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嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans;At.Ferrooxidans)是生物冶金工业中十分重要的一种细菌。它是一种嗜酸的,需氧的,化能自养的,γ型蛋白质细菌,它的能量来源是通过氧化亚铁或氧化还原性无机硫,最适pH为1.8-2.2。
NRAMP(natural resistance-associated macrophage protein)家族的功能是转运金属离子,从细菌到人都发现NRAMP的存在。在At.Ferrooxidans中,有两个NRAMP成员,它们是AFE_2126和AFE_2920。本文首先通过测序At.ferrooxidans DC和At.ferrooxidans DY15两株菌的AFE_2126和AFE_2920基因,通过序列比对发现At.ferrooxidansDC的AFE_2126基因与标准菌At.ferrooxidans ATCC23270的AFE_2126基因序列完全相同,而At.ferrooxidans DY15菌的AFE_2126基因序列与标准菌At.ferrooxida ATCC23270菌的AFE_2126基因序列相比,有7处碱基位点发生了突变,但由于氨基酸的简并性,只有一个氨基酸位点发生了突变(T48),由苏氨酸(T48,At.ferrooxidans DC)突变成蛋氨酸(M48,At.ferrooxidans DY15);At.ferrooxidans DC的AFE_2920基因与标准菌At.ferrooxidansATCC23270的AFE_2920基因序列完全相同,At.ferrooxidans DY15的AFE_2920基因序列与标准菌At.ferrooxidans ATCC23270的AFE_2920基因序列相比有12处发生了突变,但由于氨基酸的简并性,只有一个氨基酸位点发生了突变(A343),丙氨酸(A343,At.Ferrooxidans DC)突变成缬氨酸(V343,At.ferrooxidans DY15)。
通过蛋白质亚细胞定位(PSORTb v2.0 server),得知At.Ferrooxidans DC和At.ferrooxidans DY15的AFE_2126和AFE_2920蛋白质均位于细胞质膜上;通过跨膜分析(TMHMM v2.0 server),得知AFE_2126和AFE_2920蛋白质均跨膜11次。
通过转运基序分析(Motif Scan server)得知At.ferrooxidans DC和At.ferrooxidans DY15的AFE_2126和AFE_2920的NRAMP保守转运基序分别为5-QVIASIFMPAAMLFLLMLLNDREIMGSYVNRR-3和5-IITAAQSGAQWGFKLLLLQFVLMPILYIVQELTVRLGIFTGK-3。
通过PCR和测序得到At.ferrooxidans DC的7个候选内参基因的序列和大小为AFE_2121(map,810 bp),AFE_275(gmk,639 bp),AFE_2714(rplL,387 bp),AFE_2150(gvrA,2538 bp),AFE_2114(recA,1038 bp),AFE_1680(era,915 bp),AFE_2711(rpoC,4155 bp)。通过序列比对发现,这7条序列与标准菌At.ferrooxidans ATCC23270的ATE_2121(map),AFE_2475(gmk),AFE_2714(rplL),AFE_2150(gyrA),AFE_2114(recA),AFE_1680(era),AFE_2711(rpoC)的序列完全相同。
用RT-qPCR(the Reverse Transcription fluorescence-basedquantitative real-time PCR)分析了At.ferrooxidans DC菌在6个不同培养条件下的7个候选内参基因的转录水平,用geNorm评估了7个候选内参基因mRNA的转录稳定性,转录稳定的顺序由大到小是era,gmk,rpoC,gyrA,recA,map,rplL。
选择mRNA转录最稳定的3个基因(era,gmk,rpoC)作为目标基因的内参基因,研究了At.ferrooxidans DC目标基因AFE_2126和AFE_2920基因的mRNA在不同亚铁离子的浓度下的转录水平,表明随着亚铁离子浓度的增加,基因AFE_2126的转录水平降低,但是AFE_2920基因转录水平没有明显变化趋势。