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目的观察吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone,PQQ)对促进兔膝关节软骨细胞的增殖及对IL-1β介导的软骨细胞凋亡的影响,以探讨PQQ在保护软骨细胞方面的作用机制。方法1.在无菌的环境下取1月龄的新西兰白兔的膝关节软骨组织,加入0.2%的Ⅱ型胶原酶对其进行消化,消化完成后用200目钢网过滤、离心、重悬软骨细胞于含10%FBS及1%双抗的DMEM/F-12培养液中,然后放于37℃,5%CO2孵箱中培养软骨细胞。2.倒置相差显微镜下观察原代软骨细胞自接种到培养皿中开始直到基本长满培养皿底部时的不同时期的形态。3.取第2代对数生长期的软骨细胞,调整至合适的细胞密度,细胞贴壁后用PQQ浓度分别为0,6.25,12.5,25.0,50.0,100.0μmol/L的无血清培养基分别培养软骨细胞48h,采用MTT法来检测软骨细胞的增殖活力。4.将第2代对数生长期的软骨细胞调至适当密度后接种于6个100mm培养皿中,24h贴壁后,弃上清,分别加用PQQ浓度为0,6.25,12.5,25.0,50.0,100.0μmol/L的无血清培养基继续培养30h,收集软骨细胞,取1ml的单细胞悬液离心去掉上清,加入70%冷乙醇500μl固定,4℃过夜,PBS洗去固定液,加入100μl RNase A37℃水浴30min,再加入400μl的Propidium Iodide染色混匀后用流式细胞仪检测细胞周期,计算软骨细胞增殖指数。5.在100mm培养皿中接种软骨细胞,细胞贴壁后用PQQ浓度分别为0,6.25,12.5,25.0,50.0,100.0μmol/L无血清培养基预处理软骨细胞24h,然后加入终浓度为10 ng/mL的IL-1β,继续作用15h,收集上清液,与用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化收集后的细胞悬液混合,离心,预冷PBS洗涤细胞,加入200μl的Binding Buffer悬浮细胞,然后加入5μl的Annexin V-FITC(AV)混匀,继续加入5μl Propidium Iodide(PI)混匀,避光、室温孵育15min,加入300μl Binding Buffer轻轻混匀。采用流式细胞术测软骨细胞的凋亡率。结果1.实验中的软骨细胞贴壁后细胞呈现三角形、多角形或不规则形,当软骨细胞生长连接成片时可见呈现“铺路石样”。2.MTT实验结果显示,与对照组相比软骨细胞的增殖活力随PQQ浓度的增加而成逐渐升高的趋势,差异具有统计学意义(P<0.05),在PQQ浓度为25.0μmol/L时达到最大值,50.0μmol/L和100.0μmol/L时细胞增殖活力下降。3.PQQ能明显提高软骨细胞的增殖活力、S(%)期,G2/M(%)的比例和软骨细胞的增殖指数(P<0.05),且在PQQ浓度为12.5μmol/L和25.0μmol/L时作用最强。4.PQQ能明显抑制IL-1β介导的软骨细胞早期凋亡和晚期凋亡(P<0.05),在PQQ浓度为25.0μmol/L时作用最明显。结论PQQ可以促进膝关节软骨细胞的分裂与增殖,对IL-1β介导的软骨细胞的凋亡具有抑制作用。