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核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的菌核病是油菜等许多作物上的重要病害,目前对这一病害缺乏经济、有效及稳定的防治措施,急需探讨新的防治策略。利用由真菌病毒引起核盘菌致病力衰退,对生物防治菌核病具有潜在的应用价值。本研究以陕西省汉中市发病油菜茎秆内菌核分离的SX466为材料,它的菌丝为短绒毛状、菌落边缘致密、表面上形成大量白色气生菌丝、菌丝尖端弯曲、菌丝生长速度缓慢、不产生菌核、致病力弱、表现出明显的低毒现象。经克隆分析发现它携带了三种真菌病毒:Sclerotinia sclerotiorum megabirna virus 1(Ss MBV1),基于Rd Rp的进化分析,清楚的表明它和Rosellinia necatrix megabirnavirus 1(Rn MBV1)亲缘关系最近,相似率44%;Sclerotinia sclerotiorum mitovirus 2/SX466(Ss MV2/SX466)和Sclerotinia sclerotiorum mitovirus 2的另两个种同源性高度92%;Sclerotinia sclerotiorum partitivirus/SX466(Ss PV/SX466)和Grapevine partitivirus(GPV)有60%相似度,本文重点研究Ss MBV1。Ss MBV1的基因组c DNA全长由两条ds RNA片段构成,L1-ds RNA有8806 bp,L2-ds RNA有7909 bp。它可形成直径约45 nm的球形病毒粒子,病毒粒子蛋白指纹图谱分析结果表明,Ss MBV1的外壳蛋白主要由ORF1编码的CP组成。L1-ds RNA有两个阅读框(ORF1和ORF2),分别编码CP蛋白和Rd Rp蛋白。ORF1和ORF2没有重叠区域,中间间隔114 bp,但在ORF2起始密码子上游有一段不含终止密码子的区域,位于ORF1终止密码子的上游,存在典型的七核苷酸移码motif“XXXYYYZ”,靠近它下游的位置存在假定RNA“假结体”,二者具备核糖体移码的条件,因此,ORF2可以通过核糖体移码与ORF1形成一个融合蛋白。L2-ds RNA有两个阅读框(ORFA和ORFB),编码两个功能未知的蛋白。推定的ORFA编码蛋白的N末端215-306 aa位置,有一个蛋白酶结构域(Peptidase_C7,pfam01830),它和已知的Cryphonectria hypovirus 1(CHV1)木瓜半胱氨酸蛋白酶样蛋白p29有29%的相似度,表明二者亲缘关系相对较远,推定可能是在ss RNA病毒与ds RNA病毒间发生了水平基因转移。通过序列比对分析,可以很明显看出L1-ds RNA和L2-ds RNA的5’末端序列有高达98%相似度。二者5’末端前250nts完全一样,高度保守,形成稳定的茎环结构,而3’末端没有明显保守区域,也能形成茎环结构。Ss MBV1可以通过核盘菌菌丝融合的方式水平传播给营养体不亲和的核盘菌无毒菌株1980hyg,并可形成和SX466中一样大小的病毒粒子,如1980hygV1和1980hygV3,而且还发现在传递过程中L2-ds RNA丢失,如1980hygV2。Ss MBV1的病毒粒子可以直接侵染核盘菌无病毒菌株的原生质体,再生的菌株核酸带型、病毒粒子形态均和SX466中的相似,如A367RV1和A367RV2。同样发现在转染过程中L2-ds RNA可以丢失,如A367RV3和A367RV4。可见病毒粒子在形成过程中L1-ds RNA和L2-ds RNA是分别单独组装成病毒粒子。RT-PCR和Northern杂交试验进一步证明了Ss MBV1序列的特异性以及L2-ds RNA丢失的现象。通过水平传播试验和PEG介导的病毒粒子转染核盘菌原生质体试验均证明了Ss MBV1可以传播,而且L2-ds RNA/Ss MBV1可以丢失。两种类型的水平传播衍生菌株和转染子间菌落形态、生长速度和致病力均没有显著差异,可见L2-ds RNA/Ss MBV1对寄主真菌的表型没有影响或影响很小。RT-PCR和q PCR检测进一步证明了L2-ds RNA/Ss MBV1丢失,当L2-ds RNA丢失后,L1-ds RNA的表达量比没丢失的表达量低,推定L2-ds RNA可能会促进L1-ds RNA的累积。丢失L2-ds RNA/Ss MBV1的菌株中病毒粒子数量明显少于不丢失的菌株,可见,L2-ds RNA/Ss MBV1会影响病毒粒子的稳定性。为了研究L2-ds RNA/Ss MBV1的功能,采用基因沉默技术,分别构建了L2-ds RNA中ORFA编码的类似p29蛋白的基因和L1-ds RNA中ORF2编码的Rd Rp基因的RNAi沉默载体,通过农杆菌介导转化,得到的转化子菌落形态和原始菌株SX466相似,而且仍能检测到较亮的核酸条带,沉默效果不佳。通过对Ep-1PNA367/A367RV1/A367RV3高通量转录组测序,三个菌株中存在一些差异表达基因,这些基因参与了次生代谢产物合成的代谢途径,包括如细胞色素P450(Cytochrome P450s)、非核糖体多肽合成酶(Nonribosomal Peptide Synthetase,NRPSs)以及单加氧酶(Monooxygenases)相关基因的表达。