增殖性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)是眼科常见的严重影响视功能的疾病之一，是视网膜脱离(retinal detachment，RD)的严重并发症和视网膜复位术失败的主要原因，是细胞性膜在玻璃体腔及视网膜内外表面形成和收缩导致牵引性视网膜脱离的一类病变。PVR的治疗困难，目前临床常用治疗手段为外科手术，但术后视功能恢复不理想，复发率也较高，所以药物治疗PVR成为国内外学者们日益关注的热点。但PVR具有复杂的发病机制和缓慢的病理过程，药物应能够从不同环节发挥作用，而且药物的作用时间必须足够长，才能够满足治疗的需要。迄今为止尚无临床可用的安全有效的防治PVR的药物。苦参碱(matrine)作为一种中药单体成分，其显著的抗增殖抗纤维化功能和类似于糖皮质激素样的直接抗炎作用已被证实，可以推测其在PVR的防治方面也应有上佳表现，如果制成缓释剂型，延长了药物作用时间，其防治效果会更加令人满意。本课题意在探讨研究苦参碱聚乳酸微球(matrine polyactic acid microsphere，MAT-PLA-MS)缓释系统体内外的缓释效果、在防治实验性PVR中的安全性及所发挥的作用。 第一部分苦参碱聚乳酸微球体外释放及玻璃体腔注射的安全性研究 目的: 游离药物半衰期短，为了延长苦参碱在玻璃体腔的作用时间，充分发挥药物的治疗作用，制备了其缓释系统苦参碱聚乳酸微球(matrine polyactic acid microsphere,MAT-PLA-MS)。本部分考量此长效剂型在体外的缓释性，同时观察其在玻璃体腔注射的安全性，寻找最大安全剂量。 方法: 1.采用光学显微镜和透射电子显微镜观察MAT-PLA-MS的外观形态，粒度分析仪测量其粒径。 2.采用高效液相色谱分析(high-performance liquid chromatography,HPLC)测定MAT-PLA-MS载药量，紫外分光光度法计算释药量及累积释放百分率。3.将40只实验动物随机分为四组：第一组：玻璃体腔注射游离苦参碱生理盐水溶液0.3ml(含苦参碱4mg)，10只兔20只眼；第二组：玻璃体腔注射载药微球生理盐水悬液0.3ml(含苦参碱4mg)，10只兔20只眼；第三组：玻璃体腔注射载药微球生理盐水悬液0.3ml(含苦参碱6mg)，10只兔20只眼；第四组：对照组10只兔，左眼注入生理盐水0.3ml(10只眼)，右眼注入空白聚乳酸微球(blank polyactic acid microsphere，blank-PLA-MS)悬液0.3ml(10只眼)。玻璃体腔注射前均穿刺抽取玻璃体0.3ml。注药后第1、3、7、14、21、28天以裂隙灯显微镜观察角膜、房水、晶状体是否清亮，前节炎症反应情况；间接检眼镜观察玻璃体炎症反应情况；视网膜电图(electroretinogram，ERG)检查视网膜功能损害的情况；注药后第1、7、14、28天，从各组中分别取2只实验用兔进行组织学检查(光学显微镜和透射电子显微镜)，观察视网膜组织结构的改变，以评价药物的毒副作用。第二、三组(载药微球组)给药后1、3、7、14、21、28天行眼前节及眼底彩色照相，观察载药微球在玻璃体腔内的分解过程。 结果: 1.制备的苦参碱聚乳酸微球为粉末状白色固体，微球分散性良好，粒径大小较均匀，表面光滑、致密，球形圆整、规则。粒度分析仪测量其平均粒径为2.28μm。 2.高效液相色谱法测得载药量为6.17％。体外释放672h，累积释放百分率为87.93％。 3.各实验组和对照组动物在玻璃体腔注药后的各个时间点，裂隙灯显微镜可见角膜、房水、晶状体透明，前节无明显炎症反应，间接检眼镜检查玻璃体及眼底未见异常表现。载药微球各组家兔随观察时间延长，玻璃体腔内微球表现为逐渐弥散、降解、减少，最后接近消失，玻璃体腔不遗留增殖、混浊等改变。所有对照眼在玻璃体腔注射生理盐水或空白微球悬液后的各个时间点，ERG最大反应a、b波振幅与注射前相比差异无统计学意义。游离药物4mg组在注药后1、3、7、14、21、28天a、b波振幅均下降，与注药前相比差异有统计学意义。载药微球(含苦参碱4mg)组a、b波振幅与注射前相比差异无统计学意义。载药微球(含苦参碱6mg)组a波振幅从注药后14天开始下降，与注药前相比差异有统计学意义；b波振幅在各时间点与注射前相比差异无统计学意义。所有实验组和对照组动物在玻璃体腔注射后的各个时间点，视网膜组织结构在光镜下均未见异常。透射电镜下，游离药物4mg组在注药后1天出现视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelialcells，RPE细胞)微绒毛稀疏、变短，与视细胞外节的包绕关系消失，外节排列及膜盘结构紊乱。7天出现外核层胞浆水肿，神经节细胞内质网轻度扩张，müller细胞水肿。14天及28天时仍可见到上述改变。载药微球6mg组在注药后7天、14天、28天可观察到视细胞内、外节间隙增大，但膜盘结构清楚。其余各组视网膜超微结构在各时间点均未见到异常表现。 结论: 苦参碱聚乳酸微球体外释放672h，累积释放百分率为87.93％，具有良好的缓释性。苦参碱聚乳酸微球(含苦参碱4mg)注入兔眼玻璃体腔是安全的，而游离苦参碱4mg则损害视网膜功能，药物缓释系统(drug delivery system,DDS)提高了药物的非毒性剂量。 第二部分苦参碱聚乳酸微球玻璃体腔内注射的药代动力学的实验研究 目的: 药物防治增殖性玻璃体视网膜病变的效果有赖于药物的作用时间。本部分针对药物缓释系统进行玻璃体腔内的药代动力学研究，观察苦参碱聚乳酸微球在玻璃体腔维持有效治疗浓度的时间，定量研究其在眼内的缓释特性。 方法: 将实验用兔随机分为标准及质控组3只兔(6只眼)，实验组27只兔(54只眼)。实验组再随机分为9组，每组3只兔6只眼。标准及质控组动物无需手术操作，实验组动物穿刺抽取玻璃体0.3ml后玻璃体腔注入苦参碱聚乳酸微球(含苦参碱4mg)混悬液0.3ml。注药后，在以下9个时间点10min、2h、1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d分别摘除9组实验组动物双眼眼球并制备玻璃体待检样品。应用高效液相色谱技术检测玻璃体腔药物浓度，并对该技术检测玻璃体样品的方法学进行研究。用DAS软件计算主要的药代动力学参数。 结果: 在本研究采用的玻璃体样品的处理和检测方法下，苦参碱与玻璃体内源性物质二者的色谱峰分离良好，苦参碱的保留时间为5.4 min。用此种方法检测苦参碱在玻璃体内的浓度具有很好的特异性。苦参碱在玻璃体内稳定存在，没有检测到代谢峰。玻璃体内苦参碱浓度在6.56μg/ml-210μg/ml范围内呈线性关系。苦参碱在玻璃体中的提取回收率较高，准确性好，检测方法的日内和日间变异较小，精密度高，方法的最低检测浓度较小，为1.01μg/ml，灵敏度高。玻璃体腔注入苦参碱聚乳酸微球(含苦参碱4mg)，药物在玻璃体内的平均滞留时间MRT=221.64±9.70h，半衰期t1/2=173.77±32.33h。缓释微球在玻璃体腔释药可达840h以上，840h的药物浓度为121.8±34.6μg/ml。缓释微球注入玻璃体腔后1d、3d、7d、14d、21d、28d、35d(840h)，微球中苦参碱的总体清除率(total clearance rate，TCR)分别为17.65％、32.05％、51.31％、73.98％、85.71％、92.63％、96.41％，随时间延长，排出率稳定增加。 结论: 玻璃体腔注入苦参碱聚乳酸微球(含苦参碱4mg)，药物在眼内清除较慢，清除时间明显延长，在玻璃体腔内能够长时间维持较高的浓度，表现出良好的体内缓释性。 第三部分苦参碱聚乳酸微球防治实验性增殖性玻璃体视网膜病变的效果研究 目的: 从苦参碱己知的药理作用可以推测其对增殖性玻璃体视网膜病变的防治有效。前期的系列研究已经证实了其对体外血清诱导的视网膜色素上皮细胞的增殖有较强的抑制作用，本部分探讨苦参碱聚乳酸微球在动物体内抑制实验性PVR的效果。 方法: 向30只实验动物玻璃体腔中后部注入2×105个/0.1ml的同种异体成纤维细胞悬液，制备PVR模型。将其随机分为三组：第一组：玻璃体腔注入载药微球(含苦参碱4mg)生理盐水混悬液0.3ml，10只兔20只眼；第二组：注入游离苦参碱(2mg)生理盐水溶液0.3ml，10只兔20只眼；第三组：对照组10只兔，左眼注入生理盐水0.3ml(10只眼)，右眼注入空白微球悬液(10只眼)0.3ml。玻璃体腔注射前均穿刺抽取玻璃体0.3ml。所有动物玻璃体腔手术操作后第1、3、7、14、21、28、35天用裂隙灯显微镜观察角膜、房水、晶状体是否清亮，前节炎症反应情况；用间接检眼镜、眼底彩色照相和B超检查玻璃体混浊情况、玻璃体腔内微球分解情况、玻璃体内增殖情况及视网膜是否脱离以及脱离的程度。 结论: 苦参碱聚乳酸微球兔眼玻璃体腔注射能够有效抑制实验性PVR的发生发展，其效果明显优于最大安全剂量的游离药物。 综合上述研究结果：苦参碱聚乳酸微球具有良好的缓释性能，玻璃体腔注射后毒副作用小，在玻璃体内长时间维持有效浓度，能够有效防治实验性PVR的发生发展。