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目的:糖尿病是由多种病因引起的以慢性高血糖为主要特征的内分泌代谢紊乱性疾病,发病机制复杂。近年来,在2型糖尿病患者的尸检材料中发现,90%的患者胰岛内均有纤维状的胰岛淀粉样多肽（islet amyloid polypeptide,IAPP）蛋白沉积同时伴有β细胞数量显著减少,提示IAPP病理性沉积是影响胰岛β细胞存活和胰岛素分泌的重要原因之一。因此,深入研究IAPP在胰岛β细胞内病理性沉积的机制,对探讨糖尿病的发病机理以及寻找糖尿病防治的新靶点具有重要的理论和现实意义。研究证实,金属锌离子与IAPP的合成与代谢关系密切。锌离子通过与IAPP的第18位点的组氨酸残基结合,使相邻的IAPP单体交联,最终形成纤维状的IAPP聚集体。这一现象提示胰岛β细胞内锌离子代谢失衡可能是引起IAPP淀粉样沉积的重要原因。所以,调节糖尿病患者体内锌离子稳态,维持IAPP生成与降解的动态平衡,有望成为糖尿病治疗学的新策略。本课题通过小鼠和细胞模型,观察锌离子对胰岛淀粉样多肽沉积和胰岛细胞凋亡的影响,检测锌离子对IAPP合成和代谢相关酶类及胰岛β细胞凋亡相关蛋白的影响,旨在探讨锌离子影响胰岛淀粉样多肽病理性沉积的机制,为2型糖尿病治疗新靶点的选择提供实验依据。材料与方法:本研究以hIAPP转基因小鼠和转染hIAPP基因的INS-1细胞为研究对象,检测锌离子及锌离子螯合剂对淀粉样蛋白沉积及IAPP代谢和胰岛β细胞凋亡的影响及其机制。1、采用1月龄纯合hIAPP转基因雄性小鼠,高脂高糖饮食喂养,诱导产生2型糖尿病hIAPP转基因小鼠动物模型。成模后的小鼠分别给予锌离子和锌离子螯合剂（clioquinol,CQ）处理,观察小鼠的一般状态、监测血糖和体重变化情况;应用金属自显影技术（autometallography,AMG）观察锌离子沉积情况,应用免疫荧光组织化学染色观察锌离子对胰岛淀粉样多肽和胰岛素表达的影响;应用Western blot技术检测锌离子对小鼠胰腺内IAPP、胰岛素、IAPP合成代谢相关酶类含量的影响。2、培养稳定转染hIAPP基因的INS-1细胞,分别加入ZnSO4和锌离子螯合剂（N,N,N?,N?-Tetrakis（2-pyridylmethyl）ethylenediamine,TPEN）,应用Zinquin荧光染色观察不同组别细胞内锌离子的含量变化。应用免疫荧光双标染色观察锌离子对转hIAPP基因的INS-1细胞内IAPP和胰岛素分布和表达的影响。应用ELISA方法检测锌离子对hIAPP-INS-1细胞胰岛素分泌的影响。通过流式细胞术检测锌离子对hIAPP-INS-1细胞凋亡的影响。应用Western blot技术检测转hIAPP基因的INS-1细胞内IAPP、胰岛素、IAPP合成代谢相关酶类及细胞凋亡信号通路相关蛋白含量的变化。结果:1、锌离子影响hIAPP转基因小鼠的体重和血糖。髙脂高糖喂养的hIAPP转基因小鼠血糖升高,身体消瘦,出现糖尿病症状。与对照组小鼠相比,高锌喂养组小鼠体重下降明显,血糖值迅速升高,锌离子螯合剂CQ可改善小鼠糖尿病症状。2、CQ能够鳌合胰岛内的锌离子。AMG金属离子染色结果显示高锌处理组小鼠胰岛内可见大量锌离子沉积,而Zn+CQ组小鼠胰腺内锌离子沉积明显减少。3、锌离子促进hIAPP转基因小鼠胰岛内IAPP蛋白的沉积,减少胰岛素的表达。免疫荧光双标染色结果显示IAPP与胰岛素共表达于胰岛β细胞胞质,高锌组小鼠胰岛内IAPP荧光染色增强,而胰岛素荧光强度减弱。与高锌组比较,Zn+CQ组小鼠IAPP沉积减少,胰岛素表达增加。Western blot结果与免疫荧光染色结果一致,高浓度的锌离子可增加IAPP蛋白的含量,降低胰岛素的表达量,CQ能够逆转这一现象。4、锌离子影响hIAPP转基因小鼠胰腺内IAPP的合成。Western blot结果显示:与对照组相比,锌离子可增加hIAPP转基因小鼠胰腺内羧肽酶（carboxypeptidase,CPE）的含量,CQ处理可降低CPE的表达量,但是激素酶原转换酶1/3（prohormone convertase1/3,PC1/3）和激素酶原转换酶2（prohormone convertase 2,PC2）不受锌离子和锌离子螯合剂的影响。5、MTT比色实验结果显示50μM的ZnSO4和1μM的TPEN孵育12h,不影响hIAPP-INS-1细胞的活性。6、Zinquin荧光染色显示50μM的ZnSO4使hIAPP-INS-1细胞内锌离子荧光强度增加明显,而锌离子螯合剂TPEN能够螯合锌离子,降低hIAPP-INS-1细胞内的锌离子荧光强度。7、高浓度的锌离子增加hIAPP-INS-1细胞内IAPP的表达,减少胰岛素的表达。免疫荧光双标染色结果显示:高锌（Zn）组细胞内IAPP表达增强,胰岛素表达减弱;而锌螯合剂TPEN干预组（Zn+TPEN）细胞内IAPP表达明显低于高锌组,胰岛素表达增加。Western blot结果证实高锌降低细胞内胰岛素的分泌,增强IAPP蛋白的表达,TPEN能够减弱锌离子的作用。ELISA实验也证实过多的锌离子减少hIAPP-INS-1细胞分泌胰岛素的能力。8、锌离子影响hIAPP-INS-1细胞中IAPP合成酶的含量。Western blot结果显示:IAPP合成过程中的关键酶CPE受锌离子调控,高浓度锌离子明显增加CPE的表达,锌离子螯合剂降低CPE的含量。但是锌离子和锌离子螯合剂对PC1/3和PC2却无明显影响,蛋白含量无明显差别。9、流式细胞术检测结果证实锌离子诱导hIAPP-INS-1细胞发生凋亡,锌离子螯合剂能够抑制高锌诱导的细胞凋亡。10、锌离子通过ERK/JNK信号通路影响hIAPP-INS-1细胞凋亡。我们应用Western blot技术检测了高锌和锌螯合剂组细胞内P-ERK,ERK,P-JNK,JNK,P-c-jun,c-jun和caspase-3的含量,结果证实锌离子通过激活ERK/JNK通路,增加caspase-3蛋白的表达,促进hIAPP-INS-1细胞发生凋亡,TPEN抑制锌离子诱导的细胞凋亡。结论:1、高浓度锌离子可明显增加hIAPP转基因小鼠和hIAPP-INS-1细胞合成IAPP的能力,减少胰岛素的分泌,加重糖尿病症状。2、高浓度的锌离子可明显增强羧肽酶的活性,但是不影响激素酶原转换酶的表达,造成异常IAPP中间产物的增加,加剧淀粉样沉积。3、锌离子螯合剂能够抑制高锌诱导的细胞凋亡。4、高浓度的锌离子可激活胰岛细胞内ERK/JNK介导的细胞凋亡信号通路,诱导细胞凋亡的发生。