目的:在世界范围内,胃癌死亡率占恶性肿瘤死亡率的第二位。近几十年来,胃癌的发生部位发生明显变化,来源于胃远端部位(胃窦)胃癌的发生率明显下降,而食管胃交界部位(esophagogastric junction,EGJ)肿瘤(包括远端食管腺癌和贲门腺癌)的发生率呈明显增高趋势。从上世纪90年代开始,河北省食管癌、胃癌高发区居民贲门腺癌的发病率呈现逐渐增高的趋势。正常情况下,由于胃黏膜自身修复功能和各种胃黏膜保护因子的作用,胃黏膜在受到创伤时很快会愈合。然而,保护因子的减少或缺失会导致胃黏膜更多地暴露于有害物质,可能诱发胃癌相关基因表达的改变,促使胃癌的发生发展。胃动蛋白基因家族(Gastrokines,GKN)是仅有的胃组织特异的胃癌相关基因,在胃组织特异表达,并能够显著抑制胃癌细胞生长。Hp感染可导致GKN1、GKN2表达显著下调及胃黏膜腺体基因改变,提示GKNs可能参与了Hp感染胃癌的发生。三叶草因子家族(trefoil factor family,TFF),包括TFF1、TFF2、TFF3三个成员,主要分泌于人体胃肠道组织粘液分泌细胞,其表达与粘蛋白MUC分泌细胞有关。TFFs的分泌可促进胃黏膜上皮细胞的移动,快速修复,防止炎症的发生,以及调节胃黏膜上皮细胞的分化,与胃癌的发生密切相关。以往研究发现,Hp感染可影响胃黏膜上皮细胞TFFs及GKN的表达。Hp感染引起胃黏膜损伤需要与TFF1结合形成二聚体,TFF1可能是Hp感染的受体。而且,TFF1可能与GKN2结合形成异二聚体复合物在正常胃黏膜上皮发挥保护作用,细胞中TFF1与GKN2解离可使TFF1、GKN2失去正常的功能,从而促进肿瘤的发生发展。然而,尚无确切证据表明TFFs、GKN2在不同部位胃癌发生中的作用及机制,与不同部位胃癌发生中Hp感染的关系仍不清楚。因此,本研究采用免疫组化技术比较贲门腺癌与远端胃腺癌中TFF1、TFF2和GKN2的表达情况;同时采用细胞培养及分子生物学及时观察Hp主要致病蛋白对胃黏膜永生化细胞株(GES-1)细胞增殖及TFF1、TFF2、GKN2表达的影响,深入分析Hp感染与胃粘膜保护因子在胃癌发病中的作用及机制,为胃癌的合理防治提供科学的理论依据。方法:选取2011-2014年河北医科大学第二医院手术切除胃癌组织标本共113例,其中贲门腺癌61例(肿瘤中心在Z线上1cm和下2cm以内),远端胃腺癌52例。另外选取同期胃癌手术切除残端正常胃粘膜23例作为对照。运用免疫组织化学方法比较TFF1、TFF2及GKN2在贲门腺癌与远端胃腺癌中的表达情况。采用细胞培养、Real-time PCR及Western Blot等技术探讨Hp致病蛋白Cag A对GES-1细胞增殖及TFF1、TFF2和GKN2表达的影响。结果:1胃癌肿瘤组织中TFF1、TFF2、GKN2的表达情况TFF1、TFF2及GKN2免疫组化阳性产物呈棕黄色颗粒,定位于细胞浆。胃癌患者肿瘤组织中TFF1、TFF2及GKN2的表达分别为42.5%(48/113)、46.9%(53/113)及29.2%(33/113),均明显低于正常胃黏膜中的表达(P<0.05)。2比较贲门腺癌与远端胃腺癌中TFF1、TFF2及GKN2的表达2.1比较TFF1在不同部位胃腺癌中的表达免疫组化结果显示,贲门腺癌和正常对照组胃黏膜中TFF1阳性表达率分别为42.6%(26/61)、87.0%(20/23),二者相比具有显著差异(P<0.05)。远端胃腺癌组织中TFF1表达42.3%(22/52)明显低于正常对照胃粘膜87.0%(P<0.05)。比较贲门腺癌与远端胃腺癌中TFF1的表达,结果发现不同部位胃癌中TFF1的表达无明显差异(P>0.05)。在远端胃腺癌患者中,TFF1的阳性表达与浸润程度、淋巴结转移密切相关(P<0.05)。而在贲门腺癌患者中,TFF1的阳性表达与浸润程度、淋巴结转移无明显关系。2.2 TFF2在不同部位胃腺癌中的表达免疫组化结果显示,TFF2在贲门腺癌及远端胃腺癌组织中的阳性表达率分别为49.2%(30/61)、44.2%(23/52),均明显低于正常对照胃粘膜组织91.3%(P<0.05),但贲门腺癌与远端胃腺癌中TFF2的表达无明显差异(P>0.05)。在贲门腺癌及远端胃腺癌中,TFF2的阳性表达与性别、年龄、浸润程度、淋巴结转移以及肿瘤分期均无明显相关。2.3 GKN2在贲门腺癌与远端胃腺癌组织中的表达贲门腺癌和正常对照胃粘膜中GKN2阳性表达率分别为29.5%(18/61)、77.3%(18/23),二者相比具有显著差异(P<0.05)。远端胃腺癌组织中GKN2表达28.8%(15/52)明显低于正常对照胃粘膜77.3%(18/23,P<0.05)。不同部位胃腺癌中GKN2表达无明显差异(P>0.05)。在远端胃腺癌患者中,GKN2的阳性表达与淋巴结转移密切相关(P<0.05)。而在贲门腺癌患者中,GKN2的阳性表达与淋巴结转移无明显关系。3贲门腺癌和远端胃腺癌中Hp感染对于TFF1、TFF2及GKN2表达的影响在113例样本中,贲门腺癌61例,其中Hp阳性45例。伴有Hp感染患者TFF1阳性表达率为33.3%,明显低于未感染Hp患者组68.8%(P<0.05)。在Hp感染胃癌患者肿瘤组织中TFF2阳性表达率明显低于未感染者(40.0%vs 75.0%,P<0.05)。Hp感染贲门腺癌患者GKN2蛋白阳性表达为22.3%,明显低于未感染组50%(P<0.05)。在52例远端胃腺癌中,伴有Hp感染者40例。Hp感染胃癌患者TFF1、TFF2及GKN2蛋白阳性表达率分别为32.5%、35.0%、20.0%,均明显低于Hp未感染患者组(P<0.05)。4 Hp主要致病蛋白Cag A对GES-1细胞增殖的影响4.1 MTT检测结果MTT检测结果显示,不同浓度Cag A蛋白处理GES-1细胞24h后,GES-1细胞增生明显,且呈剂量依赖性,在10μg/ml细胞增生达到高峰。然后随着干预药物剂量的增加,细胞增生逐渐降低。4.2 Cag A对细胞CDK4、Cyclin B1、PCNA表达的影响采用不同浓度Cag A蛋白刺激GES-1细胞,Real-time PCR结果显示,CDK4、Cyclin B1、PCNA在2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml组中的表达均明显高于对照组(P<0.05)。Western blot结果发现各个浓度干预组CDK4、Cyclin B1、PCNA蛋白表达均比对照组明显升高。5 Cag A对GES-1细胞中TFF1、TFF2及GKN2表达的影响5.1 GES-1细胞中TFF1、TFF2及GKN2 mRNA水平变化Real-time PCR结果显示,Cag A干预3h时,10μg/ml组TFF1、TFF2及GKN2表达均明显高于其它浓度组(P<0.05)。而干预6h后,10μg/ml组TFF1、TFF2及GKN2表达却明显低于其它浓度组(P<0.05)。24h时,Cag A2.5μg/ml干预组TFF1、TFF2及GKN2表达水平较对照组明显降低(P<0.05)。结果提示,Cag A不同的干预浓度及作用时间可影响胃黏膜保护因子m RNA水平的变化,降低其保护作用。5.2 TFF1、TFF2、GKN2蛋白水平表达情况Western blot结果表明,经Cag A蛋白处理GES-1细胞24h后,2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml组TFF1、TFF2及GKN2蛋白表达均较对照组明显降低。结论:1胃癌组织中TFF1、TFF2、GKN2的表达明显低于正常胃粘膜组织,在贲门腺癌及远端胃腺癌间无明显差异,提示胃粘膜保护因子的缺失可能在胃癌的发生中发挥重要作用,但与发病部位无明显相关。2幽门螺杆菌感染可明显抑制GES-1细胞中TFF1、TFF2及GKN2的表达,提示Hp感染可能通过降低胃黏膜保护因子的生成,加重胃粘膜损伤,进而导致胃癌的发生。3小剂量Cag A蛋白干预GES-1细胞,细胞增生明显,CDK4、Cyclin B1、PCNA表达明显增多,结果提示Hp感染可影响胃粘膜上皮细胞的增殖活性,进而导致细胞损伤。