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Bcr/Abl融合蛋白由多个功能域组成,其中位于Bcr N端1～72氨基酸内的OD域(oligomerization domain,OD)介导Bcr/Abl寡聚化,是Bcr/Abl自身磷酸化,导致分子构型改变,最终异常激活Abl内酪氨酸激酶的关键因素。因而我们推测通过体外合成OD蛋白转导入细胞干扰Bcr/Abl寡聚化,有望成为CML治疗的新策略。我们选择蛋白转导域(protein transduction domain,PTD)系统携带外源性OD蛋白进入细胞,同时加入HA标签以便后续研究的免疫学检测。本实验通过构建、表达、纯化PTD-OD-HA融合蛋白,并将融合蛋白转导入CML细胞,检测细胞凋亡及增殖方面的效应,为后期开展动物体内研究奠定了基础。本课题采用的主要试验方法如下:1.PTD-OD-HA融合蛋白的克隆构建、原核表达、纯化及鉴定:通过分步克隆,分别将OD、HA和PTD基因片段顺次克隆入pET32a(+)载体,经酶切与测序鉴定后,将序列正确的pPTD-OD-HA重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用IPTG诱导PTD-OD-HA融合蛋白表达,用His·Bind树脂纯化目的蛋白,纯化的蛋白用SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和western blot进行鉴定。同时纯化对照蛋白OD-HA。2. PTD-OD-HA融合蛋白对Bcr/Abl阳性细胞凋亡的影响:通过流式细胞术、DNA ladder实验及电镜检测细胞凋亡;RT-PCR和western blot检测凋亡相关基因bax、bcl-2 mRNA和蛋白水平的改变。3. PTD-OD-HA融合蛋白对Bcr/Abl阳性细胞增殖的影响:通过MTT实验、流式细胞术、瑞氏染色以及电镜观察细胞周期和形态改变;RT-PCR和western blot检测周期相关基因cyclin D1、c-myc mRNA和蛋白水平的改变。通过以上实验,得到以下主要的结果或结论:1.成功地构建了pPTD-OD-HA和OD-HA原核表达载体,成功地表达出PTD-OD-HA和OD-HA融合蛋白,其最佳诱导表达条件分别是: 0.1mmol/L IPTG 37℃诱导6h,1.0mmol/L IPTG 37℃诱导4h;经SDS-PAGE考马斯亮蓝染色和western blot验证了纯化蛋白的正确性。2. PTD-OD-HA融合蛋白进入细胞后,能特异性地引发Bcr/Abl阳性细胞发生凋亡,对Bcr/Abl阴性细胞的凋亡不产生影响;DNA ladder实验检测到凋亡细胞因DNA断裂而产生的典型的梯状条带;电镜观察到凋亡小体;RT-PCR及western blot检测凋亡相关基因bax mRNA和蛋白水平都升高,而bcl-2 mRNA和蛋白水平都降低。3. PTD-OD-HA蛋白作用于K562和BaF3-P210两种Bcr/Abl阳性细胞后,MTT实验观察到PTD-OD-HA融合蛋白能减慢Bcr/Abl阳性细胞生长;流式细胞术检测发现细胞被阻滞在G1期;瑞氏染色以及电镜观察细胞形态发生改变,胞浆中出现大量的空泡,线粒体普遍肿胀,溶酶体增多;RT-PCR和western blot检测到周期相关基因cyclin D1、c-myc mRNA和蛋白水平均都下降了。