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HER2/neu基因是一种原癌基因,位于人染色体17q21,其编码产物p185erbB2蛋白具有酪氨酸激酶活性,为表皮生长因子受体家族成员之一。当HER2/neu基因过度表达时,存在于多种肿瘤组织,包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和宫颈癌等均可检测到该基因。抗HER2人源化单克隆抗体直接作用于p185erbB2胞外域,因而是一种理想的靶向治疗药物。体内外实验均证明:抗HER2人源化单克隆抗体能抑制过度表达HER2/neu基因的乳腺癌细胞生长。
目前,抗体主要采用哺乳动物表达系统生产,但哺乳动物表达系统生产成本高,使每个疗程的抗体药物费用高达数万美元,难以实现抗体药物的广泛应用。乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis,K..lactis)作为一种较完善的外源基因表达系统,不仅具有易于高密度发酵、外源基因稳定整合在宿主基因组中,可对外源蛋白进行糖基化修饰等酵母共有的优点外,还具有遗传背景清楚和表达系统安全等优点。K..lactis表达系统已成功表达多种外源蛋白,但尚未见用于全抗体表达的研究报道,因此,本研究拟利用K..lactis表达系统,以抗HER2单克隆抗体为模型,研究K..lactis表达系统表达全抗体的能力,并对表达产物进行结构和生物学活性的分析,为开发抗体药物生产新平台奠定基础。
本研究主要结果如下:
1.构建了抗HER2人源化单克隆抗体轻、重链表达载体,实现了全抗体在K..lactis中的表达。对用于K..lactis中的信号肽和启动子进行初步分析,结果表明:诱导型启动子LAC4与MFα信号肽的组合能够获得较高的抗体表达水平,摇瓶表达水平可达120±20mg.L-1。
2.表达产物利用HiTraprProteinAFF亲和柱纯化,纯化产物经SDS-PAGE、Westernblot分析以及与PNGaseF酶切分析,结果显示:K..lactis表达的抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链能够协调表达,并且能够自发通过分子间二硫键正确装配成完整的抗体分子,且抗体的重链发生N-糖基化修饰。
3.ELISA实验结果显示抗HER2人源化单克隆抗体可与其抗原特异性结合。而且该抗体对过度表达HER2基因的SKBR3细胞的生长具有一定的抑制作用。