嗜肺巴斯德杆菌是SPF级实验小鼠必须排除的特定病原体之一,它的存在会加重其他病原的感染,除了损害小鼠自身的健康和生产,还会对科研实验造成不可预知的影响。由于实验动物的特殊性,无法通过药物治疗嗜肺杆菌,因此主要靠饲养管理来预防,加上定期有效的抽样检测作为保障的关键手段。本试验目的是通过对比国家标准推荐的生化培养检测方法和PCR检测技术,来寻找一个更高效、可靠的鉴定方式,为SPF级实验小鼠建立更好的健康监测程序。试验一、国标法检测SPF级小鼠嗜肺巴斯德杆菌本试验选取5个品系不同性别的2月龄到12月龄SPF级的实验小鼠,分为实验种群和哨兵鼠。严格按照屏障设施的SOP进行饲养管理,饲养1个月以上用于该试验。按照国家标准推荐的方法,共检测267只小鼠,经过剖检取样,分离培养,结果显示符合菌落形态,染色为革兰氏阴性小杆菌的分离株共1 16个。进一步再经生化鉴定,符合DHL培养基不生长,硝酸盐还原阳性、尿素酶阳性、过氧化氢阳性、硫化氢阳性、明胶阴性等的菌株判定为嗜肺杆菌阳性,不符合判为阴性。本试验结果显示严格意义上全部符合阳性判断标准的分离株为0。在试验过程中阴性判定的情况有:无菌落生长;生长菌落为革兰氏阳性球菌;生化项目不符合等(如硫化氢阴性、硝酸盐阴性、尿素酶阴性等明显不符的项目)。通过增加生化项目,前后共使用了 33个生化指标,但没有特异性的生化指标可以有效地鉴定嗜肺巴斯德杆菌。目前只依靠国标推荐的检测方法会造成很大的漏检和误判。试验二、嗜肺巴斯德杆菌的PCR鉴定与鉴别本试验取相同饲养条件的小鼠542只,经剖检分离培养,挑取符合菌落形态及染色特征的,转接血平板进行纯化培养,抽提纯化细菌DNA,进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳,在1030bp左右有目的片段的菌株共91个,PCR检测嗜肺巴斯德杆菌阳性率为1 7.5%。为了进一步验证细菌的特异性,再用细菌通用引物进行PCR扩增后测序,进行序列比对后发现,嗜肺巴斯德杆菌阳性菌株共57个,1个肠球菌,1个肠杆菌,6个粪肠球菌,1个表皮葡萄球菌,1个巴氏葡萄球菌,3个芽孢杆菌,1个鹑鸡肠球菌,1个奇异变形杆菌,14个放线杆菌,2个博代氏杆菌,另有3个菌株测序未成功。嗜肺巴斯德杆菌阳性检出率为10.96%,PCR扩增的准确率为62.64%。由此可见,嗜肺杆菌在实验动物设施中存在一定比例的感染,通过传统分离纯化培养,结合PCR扩增技术和测序比对,能极大地增加检出率和准确度。从结果数据中可以看出,通过不间断的对设施小鼠的检测,可以很好的了解病原菌在动物品系中的分布情况和时间段上的感染特征。