氮素是植物生长发育所需要的最重要的大量元素之一,大多数的陆生植物以吸收NO₃^-作为主要氮源,在农业生产上,NO₃^-供应直接影响到作物的生长及作物的产量。在许多发达国家和发展中国家,过多的氮肥应用到农业生产中,但作物氮肥的有效利用率低,导致相当一部分肥料没有被植物吸收利用而流失到环境中,造成一系列的环境污染,如水体富营养化、土壤酸性化等。这些问题已日趋严重,亟待解决。解决上述问题的关键是提高作物对氮素的有效利用率。阐明关键基因调控NO₃^-吸收利用的分子机制,解析NO₃^-调控基因的调控网络,将为提高作物对氮素的有效利用率提供理论依据和指导。国内外的研究者在培育高氮效新品种、提高氮肥利用率方面做了大量工作,但迄今为止进展仍十分有限,因此,迫切需要加强对NO₃^-调控基因及其调控网络的研究。一、NRG2调控NRT1.1的分子机制NRG2（Nitrate Regulatory Gene 2）是通过正向遗传学鉴定到的参与调控NO₃^-初级响应的基因,本文对NRG2在基因表达、蛋白定位、NO₃^-的积累和同化、与NRT1.1（Nitrate Transorter1.1）基因的调控关系等方面进行了深入研究。首先,分析了不同氮素条件对NRG2基因表达及蛋白定位的影响,在NO₃^-、NH4+和氮饥饿分别处理野生型后,检测植株体内NRG2基因的表达,发现NRG2基因的表达量没有显著变化,说明NRG2基因的表达不受NO₃^-、NH4+和氮饥饿的调控;在有NO₃^-和无氮条件下,利用GFP融合蛋白观察了 NRG2的蛋白定位,发现NRG2蛋白在两种条件下均定位于细胞核,说明NRG2的定位不受氮素的影响。为探明nrg2突变体中NO₃^-积累减少的原因,通过对不同时间处理、不同NO₃^-浓度处理下nrg2突变体对NO₃^-积累量的检测,发现在这两种情况下nrg2突变体中的NO₃^-含量都显著低于野生型;对nrg2突变体中NO₃^-转运基因表达的检测发现nrg2突变体中NRT1.1的表达显著降低。我们还检测了nrg2突变体中硝酸还原酶（NR）的活性,发现其NR活性并没有显著变化,编码NR的两个基因NIA1和NIA2的表达也没有显著变化,说明nrg2突变体中NO₃^-积累减少的原因可能是植株对NO₃^-的吸收降低造成的。为研究NRT1.1与NRG2之间的关系,我们构建了NRT1.1与两个基因的双突变体chl1-13 nr2-（chl1-13为NRT1.1带有YFP荧光的突变体）,检测了双突变体中的NO₃^-含量和NO₃^-诱导基因的表达,发现双突变体的NO₃^-含量和NO₃^-诱导基因的表达均趋近于chl1-13单突变体,说明NRG2与NRT1.1两个基因位于相同的NO₃^-信号通路,且NRG2位于NRT1.1基因的上游。我们还将NRT1.1基因在nrg2-2突变体中过表达,获得纯合转基因株系NRT1.1/ng2-2,对转基因株系的NO₃^-含量和NO₃^-诱导基因的表达进行了分析,发现转基因株系NRT1.1/nrg2-2中的NO₃^-含量和NO₃^-诱导基因的表达均能恢复到野生型水平,进一步说明NRG2位于NRT1.1基因的上游调控其表达。我们还对野生型、nrg2-2突变体、chl1-13突变体分别经过NO₃^-诱导,取其根部进行了转录组分析,发现278个可被NRG2和NRT1.1共同调控的基因,对这些基因进行GO（Gene Ontology）分析,发现了一个与氮素转运相关的cluster,该结果从全基因组的水平上证明了 MRG2与NRT1.1位于相同的NO₃^-信号调控通路。NRG2家族成员含有两个未知功能的保守结构域,预测其具有结合DNA的功能。为验证NRG2是否能与NRT1.1基因启动子结合,我们构建了带有FLAG标签的互补株系NRG2/nrg2-2,利用ChIP-qPCR及ChIP-PCR技术证明了 NRG2在体内可以和NRT1.1基因的启动子结合。二、NLP7调控NRT1.1的分子机制本研究还对两个重要的NO₃^-调控基因NRT1.1和NLP7（Nodule IIneption-like Protein 7）之间的关系进行了研究。结果表明在NH4+存在时,nlp7突变体中NRT1.1的表达量下降,而在nrt1.1突变体中NLP7基因的表达并没有发生变化;同时我们还构建了这两个基因的双突变体chl1-13 nlp7-14（nlp7-4为NLP7带有YFP荧光的突变体）,对双突变体chl1-13nlp7-4的荧光表型进行了观察,发现双突变体的荧光更趋近于荧光弱的单突变体;我们还对双突变体chl1-13 nlp7-4的NO₃^-含量和NR活性进行了检测,发现双突变体的NO₃^-含量和NR活性均更加趋近于nrt1.1单突变体,这些结果均说明NLP7与NRT1.1位于相同的NO₃^-信号调控通路,且NLP7位于NRT1.1基因的上游。我们又将NRT1.1基因在nlp7-4突变体中过表达,得到纯合转基因株系NRT1.1/nlp7-4,检测该转基因株系的荧光亮度、NR活性及NO₃^-诱导基因的表达,发现NRT1.1可以恢复nlp7-4突变体的表型,进一步说明NLP7位于NRT1.1基因的上游。同样用NO₃^-处理野生型、chll-13突变体、nlp7-4突变体,进行转录组分析,发现有342个基因可被NLP7与NRT1.1共同调控,对这些基因进行GO分析,结果表明有两个与氮素代谢相关的clusters,从全基因组水平上说明了NLP7与NRT1.1可在同一通路种调控NO₃^-信号。对NLP7单独调控的186个基因进行GO分析,数据表明有两个与氮素相关的clusters,说明NLP7除了和NRT1.1在同一通路中调控N03-信号外,还可能存在不依赖于NRT1.1的调控通路。前人的ChIP-chip实验表明NLP7可以直接结合NRT1.1,为验证这个结论,我们利用带有GFP标签的互补株系NLP7/nlp7-4设计了 ChIP实验,ChIP-qPCR和ChIP-PCR实验结果证明NLP7能够在体内与NRT71.1基因的启动子结合,进一步的EMSA实验证明,NLP7能够直接与NRT1.1的启动子结合。本研究鉴定了NRG 基因在植物NO₃^-调控方面的作用,利用遗传学手段,结合植物生理学、分子生物学实验方法及转录组分析证明了NRG 基因与NRT1.1基因位于相同的NO₃^-信号调控通路,且NRG2位于NRT1.1基因的上游;进一步的研究表明,NRG2可以在体内与NRT1.1基因的启动子结合;同时研究结果表明NRT1.1是NLP7的下游靶基因,NLP7能够结合NRT1.1基因的启动子。对这几个基因之间调控关系的研究增加了我们对NO₃^-调控基因网络的理解,为解析植物对氮素吸收利用的分子机理提供了理论依据和指导。