目的:研究DNMT抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷提高KLE细胞对孕激素类药物醋酸甲羟孕酮的药物敏感性,并初步探究5-氮杂-2-脱氧胞苷在细胞内的作用方式及其可能机制,进而为临床上孕激素治疗子宫内膜癌不理想的患者提供新的治疗思路与理论依据。方法:首先提取正常人和子宫内膜癌患者的组织DNA为模板,对其用亚硫酸氢钠进行甲基化修饰,设计甲基化特异性PCR的实验方案,从引物量,模板量,退火温度、循环数方面,确定甲基化特异性PCR对DNA甲基化检测的最佳条件。然后在最佳检测条件下对正常人以及子宫内膜癌患者组织进行DNA甲基化情况的检测。体外培养子宫内膜癌细胞株KLE与Ishikawa,用DNMT抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理细胞株后,检测细胞用药前后的DNA甲基化情况以及孕激素受体B的蛋白表达情况,并确定最佳的药物浓度与药物处理时间。联合应用DNMT抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷与孕激素类药物醋酸甲羟孕酮处理KLE细胞株,观察联合用药对于子宫内膜癌细胞的抑制率。荧光定量PCR检测用药前后细胞内DNA甲基转移酶的mRNA表达情况。结果:1、利用甲基化特异性PCR技术成功检测了子宫内膜癌患者以及健康人群组织的DNA甲基化情况,在最佳反应条件下,实验结果明显,即当甲基化特异性引物与DNA模板完全匹配时,凝胶电泳会出现对应条带,即有PCR产物;证明组织存在甲基化;反之,当非甲基化的引物与DNA模板完全匹配时,也会出现对应条带,证明组织没有发生甲基化;当即出现M带又出现U带的时候,证明组织发生了部分甲基化,部分甲基化归为甲基化的范畴内。2、甲基化特异性PCR检测了43例子宫内膜癌患者的甲基化情况,其中完全甲基化的患者为13例,部分甲基化的患者有23例,非甲基化的患者为7例。同时检测了71名正常组织的甲基化情况,其中完全甲基化的有0例,部分甲基化的患者有10例,非甲基化的有61例。与正常组织的检测结果相比,癌症组织中的DNA甲基化状态有统计学差异(p<0.0001),而与子宫内膜癌组织的检测结果相比,正常组织中的非甲基化状态有统计学意义(p<0.0001)3、体外培养子宫内膜癌细胞株KLE与Ishikawa,对用药物处理前后的KLE细胞株与Ishikawa细胞株的PRB的DNA甲基化情况进行检测,KLE细胞在经过DNMT抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理之后,其孕激素受体B基因的DNA甲基化发生了很明显的去甲基化,而在孕激素受体B中度表达的Ishikawa细胞株在药物处理前后,DNA甲基化情况基本没有变化。4、Western Blot检测DNMT抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理KLE细胞之后孕激素受体B的蛋白表达情况,结果显示,控制DNMT抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷的药物浓度为唯一变量,在同一时间里对KLE细胞株进行了不同浓度的处理,无论是在24 h,48 h,72 h组,2.5 mM浓度组都是使孕激素受体重新表达最佳的浓度。我们再将该浓度下的时间来进行组间比较,发现48小时,浓度为2.5 mM这一组为最佳时间与最佳浓度,与其他两组相比,p<0.01,具有统计学差异。5、MTT检测5-氮杂-2-脱氧胞苷处理KLE细胞之后的的细胞抑制率,结果显示48 h与24 h以及72 h相比,5-氮杂-2-脱氧胞苷处理之后的细胞抑制率最高。醋酸甲羟孕酮处理KLE之后的细胞抑制率,结果显示时间为72 h,浓度为10~-55 mol/L最佳。组跟其他组比较,细胞抑制率最大。而5-氮杂-2-脱氧胞苷与醋酸甲羟孕酮联合处理KLE细胞抑制率的结果显示,5-氮杂-2-脱氧胞苷与醋酸甲羟孕酮联合用药处理组与MPA组相比,抑制率明显提高,且p<0.001,具有统计学差异。6、荧光定量PCR检测5-氮杂-2-脱氧胞苷处理之后,KLE细胞的DNA甲基转移酶的mRNA含量。对未进行药物处理的KLE对照组以及最佳药物浓度处理组细胞内的DNA甲基转移酶的含量进行检测,DNMT 1与KLE对照组相比,mRNA的含量降低了大约2倍左右(p<0.01),DNMT 3a与KLE对照组相比,其mRNA的表达量下降了大约3倍左右(p<0.001),而DNMT 3b与KLE对照组相比,mRNA的表达量没有明显的变化,无统计学意义。结论:1、检测了子宫内膜癌患者以及健康女性的组织DNA甲基化情况,并且确定孕激素受体B的DNA甲基化与子宫内膜癌的发生发展有一定的关系。2、DNMT抑制剂5-氮杂-2-脱氧胞苷可以有效提高子宫内膜癌KLE细胞对孕激素类药物醋酸甲羟孕酮的敏感性,其机制可能是通过抑制DNA甲基转移酶DNMT 1和DNMT 3a的活性起作用的,也有可能是通过调控DNMT 1/DNMT 3b或者DNMT 3a/DNMT 3b的比值来起作用。