多重耐药性是有效治疗癌症的重大阻碍,为了解决这个难题,多种药物递送系统被发明用于克服其多重耐药性。1974的诺贝尔医学奖获得者Christian de Duve首次将溶酶体定义为“自杀包”,溶酶体膜破损可使细胞和组织自溶。当溶酶体膜通透性提高时,某些特定的组织蛋白酶将会从溶酶体释放到细胞质中,这被认为可以引起细胞凋亡和类似凋亡途径的细胞死亡。这能有效地克服了癌细胞的多重耐药性,为癌症治疗又提供了新的靶标。本论文中,以空心介孔二氧化硅纳米粒子为载体负载抗癌药物阿霉素,再通过简单的碳酸氢钠处理,得到了新型纳米载药系统——“纳米炸弹”(Nanobombs,NBs)。我们发现,碳酸氢钠处理,可以提高药物递送系统对药物的负载率;降低药物在正常生理条件下的泄露而提高其在酸性条件下的释放率;更重要的时,可以显著提高药物对癌细胞和耐药细胞的治疗效果。我们还证实,治疗效果的提高与引入碳酸氢根有关。当NBs进入细胞后,与溶酶体中的H+反应,迅速产生大量CO2气体,导致溶酶体膜通透性提高,最终诱导细胞凋亡。仅仅通过一个简单的化学处理步骤,就可以显著提高纳米药物递送系统的性能,有效克服癌细胞的耐药性,这对设计新的药物递送系统有很重要的指导意义。具体研究内容如下:(1)“纳米炸弹”的构建。用改进的Stober法合成二氧化硅微球,然后在80℃的条件下,用0.2 M碳酸氢钠溶液腐蚀2 h,最后在550℃的高温下煅烧6 h,即制得单分散性好、大小均一的空心介孔二氧化硅。以空心介孔二氧化硅为载体,负载盐酸阿霉素(Free DOX),得到负载阿霉素的药物递送系统(DMSNs);再以碳酸氢钠处理DMSNs得到“纳米炸弹”(NBs)。对DMSNs、NBs进行TEM成像,SEM成像、超声成像以及体外释放等一系列的表征。实验证实,碳酸氢钠处理可以明显提高载药系统的载药率。相比DMSNs,NBs在pH 7.4(模拟正常的生理环境)的条件下,药物泄露更少;而在pH 5.0(模拟溶酶体的微环境)的条件下,药物释放率更高(达53%)、释放更快。超声成像实验发现NBs在pH 5.0的条件下会产生大量CO2气体。当NBs进入细胞溶酶体内后,由于CO2气泡的产生促使DOX的快速释放。(2)以人肺腺癌细胞(A549)为模型,考察NBs药物递送系统的抗癌活性。将一系列浓度DOX、DMSNs、NBs分别与A549细胞孵育24、48 h后,用CCK-8法测定细胞活性。实验发现无论在24 h还是48 h,NBs的抗癌活性都是最强的。将相同浓度的三种药物与A549细胞孵育不同时间,在相同时间时还是NBs的抗癌效果最好。A549细胞与DOX,DMSNs,NBs三种药物孵育后,通过拍摄视频的方式对A549细胞的形貌进行实时监控,发现与NBs孵育的A549细胞最快发生了形貌变化,出现了皱缩、变圆、脱落等现象,这些现象是细胞凋亡的标志。荧光共定位实验发现A549细胞与NBs孵育一段时间后,NBs中的游离阿霉素主要聚集在溶酶体中,而没有进入到癌细胞的细胞核,鉴于NBs在酸性条件下会产生大量CO2,我们猜测NBs应该是通过提高溶酶体膜通透性而引起细胞凋亡。溶酶体成像实验证实了NBs处理后的癌细胞的溶酶体膜通透性提高,这一系列的结论有力的证实了NBs能提高溶酶体膜的通透性,从而诱导细胞凋亡。(3)以人乳腺癌细胞(MCF-7)和人乳腺癌细胞耐药株(MCF-7/ADR)为模型,研究NBs作为药物递送系统的抗癌活性及克服肿瘤耐药性的效果。将DOX,DMSNs,NBs分别与MCF-7细胞孵育24、48 h后,用CCK-8法测定细胞活性。同样发现,无论在24h还是48 h,NBs的抗癌活性是最强的。荧光共定位实验发现MCF-7细胞与NBs孵育一段时间后,NBs中的游离阿霉素主要聚集在溶酶体和细胞质中,而没有进入到癌细胞的细胞核。抗癌药物阿霉素只有进入细胞核才能起作用,而NBs中的阿霉素没有进入细胞核却有更高的抗肿瘤作用,说明NBs的抗癌机制与其他纳米药物递送系统不同。溶酶体成像实验发现NBs处理后的癌细胞的溶酶体膜通透性显著提高。Caspase-3酶活性检测实验证实溶酶体膜通透性提高后能使某些特定的组织蛋白酶从溶酶体释放到细胞质中,从而诱导癌细胞发生凋亡。由于NBs无需DOX即可发挥抗肿瘤作用,可以有效克服耐药细胞株对药物的外排作用,因此对对耐药细胞也具有良好的治疗效果。最后将MCF-7/ADR与DOX、DMSNs、NBs孵育48h,测定细胞活性,证实NBs确实可以有效克服癌细胞的耐药性。