青光眼(glaucoma)是第二大致盲性眼病,眼内压增高是其发病的重要因素。青光眼所导致的严重的不可逆性视功能损害,视网膜神经节细胞损伤是其基本病理基础,但关于青光眼神经损害的发病机制目前尚未完全阐明。近年来,胶质细胞的激活(reactivation, gliosis)在神经系统损伤和疾病病理过程中的作用日益受到人们的重视,几乎所有的神经系统(包括视网膜)损伤和疾病都伴随有胶质细胞的激活。胶质细胞激活,其作用包括两个方面：一是细胞对损伤所做出的急性反应,通过释放神经营养因子和抗氧化物质,以及摄取胞外集聚的谷氨酸等,从而阻止神经元的进一步损伤,促进神经轴突的再生和突触重塑；另一是激活的细胞也可释放多种细胞毒性因子,这些细胞因子作用于神经细胞,诱发其凋亡或死亡。Muller细胞是脊椎动物视网膜主要的胶质细胞。Muller细胞的激活是许多视网膜疾病共同的改变。Muller细胞激活后,首先表现为胶质细胞骨架蛋白包括神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)、波形蛋白(vimentin)和巢蛋白(nestin)表达上调,另一个特征性变化是细胞膜K+电导下调。然而,青光眼视网膜Muller细胞的K+通道是否也发生相同的改变是有待研究的科学问题。并且,Muller细胞在病理状态下的激活与K+电流下调的机制还不清楚。本课题利用膜片钳电生理、免疫荧光组织化学和Western blot等技术,研究了慢性眼内压增高大鼠Muller细胞Kir(内向整流钾通道)电流的变化,并研究了导致Kir电流变化的可能机制,分析了Kir电流变化和Muller激活之间的关系。主要的结果如下：(1)采用烧灼巩膜上静脉的方法,成果制备了大鼠慢性高眼压模型；(2)利用全细胞膜片钳记录方法,在急性分离的大鼠视网膜Muller细胞上记录到一种弱内向整流性质的Kir电流；(3)与正常动物的Kir电流相比,在慢性高眼压大鼠视网膜Muller上记录的Kir电流幅度显著降低。在我们观察的眼内压增高后的6w时间内,Kir电流幅度在制模术后前3w显著下降,虽然在第4w有所恢复,但是直至6 w,Kir电流仍然低于对照组；(4)对Kir电流抑制的机制研究发现,Kir电流的下调和Ⅲ型代谢性谷氨酸受体(mGluR I)激活有关。胞外施加mGluR I的特异性激动剂DHPG,可逆性抑制正常大鼠Muller细胞的Kir电流,其作用可被mGluR I亚型mGluR5的特异性阻断剂MPEP所拮抗,而mGluRⅢ亚型mGluR1的特异性阻断剂MPMQ不能阻断DHPG的作用,说明mGluR5亚型的激活参与Muller细胞Kir电流的下调；(5)胞内信号通路分析发现,激活mGluR I受体下调Kir电流和cAMP/PKA(3’,5’-环腺甘酸/(?)AMP依赖性蛋白激酶)信号通路无关,因为forskolin不能诱导Kir电流的改变,((?)AMP抑制剂Rp-cAMP也不影响DHPG对Kir电流的下调；同样,CaMKII也不参与DHPG的作用,CaMKII抑制剂KN62和KN93均不影响DHPG对Kir电流的作用；进一步研究发现,DHPG对Kir电流的抑制与激活PI-PLC/PKC((磷脂酰肌醇-磷脂酶C/蛋白激酶C))通路有关。胞内透析PI-PLC的特异性阻断剂U73122可完全阻断DHPG对Kir电流的压抑,而PC-PLC(磷脂酰胆碱-磷脂酶C)的抑制剂D609则没有影响。此外,PKC抑制剂Bis IV和chelerythrine chloride均可阻断DHPG对Kir电流的压抑；(6)IP3和ryanodine介导的胞内钙库钙释放参与了DHPG对Kir电流的调制。胞内透析IP3受体的竞争性阻断剂heparin可显著降低DHPG对Kir电流的抑制,但不能完全阻断；Ryanodine受体特异性激动剂caffeine可使Kir电流幅度缓慢轻度降低,但胞内透析高浓度ryanodine耗竭胞内ryanodine敏感的钙库后,DHPH抑制Kir电流的作用不再出现；此外,用钙离子螯合剂BAPTA清除胞内Ca2+, DHPG也失去对Kir电流的压抑作用。说明细胞内Ca2+-依赖的PI-PLC/IP3-ryanodine/PKC信号通路参与了DHPG对视网膜Muller细胞Kir电流的抑制作用；(7)免疫组织化学和Western blot检测结果发现,在眼内压增高的6w时间内,GFAP的表达随着时间的延长逐渐增加；Kir4.1在Muller细胞终足上的表达在2w时有降低,但是到第4w和第6w有所恢复；但Western blot对视网膜总Kir4.1表达量的检测结果显示,在制模后表达较制模前有增高,这可能和Kir4.1在视网膜多种细胞上有表达有关；(8)采用玻璃体腔注射mGluR5拮抗剂MPEP后再行巩膜上静脉烧灼制作动物模型,术后2w,取材行免疫荧光组织化学染色检测。与注射生理盐水对照组相比,注射MPEP组GFAP的表达明显下降,同时,减弱了Muller细胞Kir4.1表达的下调；(9)在正常大鼠玻璃体腔注射mGIuRI的激动剂DHPG,2 w后取材。免疫荧光组织化学结果发现,与注射生理盐水的对照组相比,注射DHPG的大鼠Muller细胞GFAP表达显著增强,而Kir4.1的表达显著减弱,提示Muller细胞的激活；Western blot的结果显示,注射DHPG组的视网膜Kir4.1蛋白含量显著降低。综上所述,在我们制作的大鼠慢性高眼压大鼠模型上发现,视网膜Muller细胞Kir电流显著降低。伴随Kir电流的下调,Muller细胞GFAP蛋白的表达显著增高,提示Muller细胞的激活。选择性激活Muller细胞的mGIuR I受体可模拟高眼压所导致的Kir电流抑制,其作用是由细胞膜的mGluR5而非mGluR1受体亚型所介导,而在细胞内是由Ca2+依赖的Pl-PLC/IP3-ryanodine/PKC信号通路所介导的。玻璃体腔注射mGIuR5受体拮抗剂MPEP,可抑制慢性高眼压模型大鼠Muller细胞GFAP表达,而注射mGluR l激动剂DHPG可诱导正常大鼠视网膜Muller细胞GFAP表达明显增高,Kir4.1蛋白表达下调。这些结果提不,mGluR5受体介导的Kir电流抑制参与了慢性高眼压视网膜Muller细胞的激活。