水稻苯丙氨酸解氨酶的表达特征和生物学功能研究

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水稻作为一种重要的农作物,为全世界半数人口提供口粮,而水稻的生产和安全常常受到一些生物和非生物胁迫,从而导致全球粮食减产,威胁世界粮食安全,因此水稻抗病抗逆的分子机理和遗传改良成为一项重要课题。苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase,PAL)是由77-83 k Da的亚基聚合形成的一种保守的同源四聚体蛋白。PAL蛋白催化苯丙氨酸的脱氨作用,在释放NH3的同时,形成碳碳双键产生反式肉桂酸(trans-Cinnamic acid,t-CA)。t-CA是多种苯丙类化合物生物合成的前体,如木质素、水杨酸(Salicylic acid,SA)、花青素和类黄酮类植物抗毒素等。虽然已经有许多研究对拟南芥At PAL基因家族个体亚型的表达特征进行调查,并对其在不同胁迫中的功能进行分析,但迄今为止对于水稻OsPAL家族成员特性以及功能研究的信息很少。本文对水稻OsPAL家族OsPAL1-OsPAL9的表达模式、酶特性进行了系统的分析,并利用突变体对该家族成员的生物学功能进行了研究,主要内容如下:(1)利用Genevestigator数据库对OsPALs基因在水稻生长发育过程中的表达模式进行统计,结果显示OsPAL1-9在水稻各个发育时期均有表达,但表达量存在差异,其中OsPAL1和OsPAL2的表达量最高。(2)分别检测年轻与衰老叶片中总SA含量与OsPALs表达量,结果表明水稻中OsPALs的表达水平与SA合成相关联。另外,我们还检测了水稻幼苗不同部位中OsPALs的表达量,结果显示OsPALs基因的表达不存在组织特异性。(3)通过构建35S:e GFP-OsPAL1、35S:e GFP-OsPAL2、35S:e GFP-OsPAL3、35S:e GFP-OsPAL4、35S:e GFP-OsPAL5、35S:e GFP-OsPAL6、35S:e GFP-OsPAL7和35S:e GFP-OsPAL9载体,并转化至水稻原生质体中,利用激光共聚焦显微镜对OsPALs的亚细胞定位进行观察,结果发现OsPAL1、OsPAL2、OsPAL6、OsPAL7定位于内质网上,OsPAL3、OsPAL4、OsPAL5、OsPAL9定位在细胞质中。(4)在重组蛋白OsPAL1-9的反应体系中都检测到反应产物t-CA,而体内酶活实验结果表明水稻中OsPALs突变后,相应的PALs酶活均有不同程度的下降。因此我们认为水稻中OsPAL蛋白均具有催化苯丙氨酸脱氨反应并生成t-CA的活性。(5)SA与木质素含量测定结果表明OsPAL1和OsPAL2突变后水稻SA含量升高,木质素含量降低;而OsPAL4突变则导致SA含量下降,木质素含量上升。说明OsPAL1和OsPAL2主要参与水稻木质素的合成,而OsPAL4则主要参与SA的合成,且水稻SA与木质素的生物合成可能存在拮抗关系。(6)对ospals突变体进行白叶枯病菌P6处理,pal1pal2突变体表现出明显的抗病表型,而pal4突变体呈现出感病表型,表明SA含量增加能提高水稻的抗病性,SA含量下降则导致植株的抗病性减弱。(7)突变体ospals的农艺性状统计结果显示,水稻中OsPAL1和OsPAL2突变导致SA含量升高,而植株中SA累积会影响植物分枝,并最终导致作物减产。OsPAL4突变所引起的SA含量下降并未影响作物最终产量,而其木质素含量升高则正调控植物茎秆的机械强度,从而影响植株的抗倒伏性。综合以上结论我们发现水稻OsPAL家族9个成员基因表达水平存在差异,其中OsPAL1表达水平最高,OsPAL1-9的表达无组织特异性。OsPALs在体外和体外都能促进苯丙氨酸的脱氨,从而产生t-CA,且OsPAL1、OsPAL2、OsPAL6、OsPAL7定位于内质网上,OsPAL3、OsPAL4、OsPAL5、OsPAL9定位在细胞质中。对OsPALs生物学功能的进一步研究我们推测以下模型:水稻中OsPALs家族9个成员可大致分为三类,OsPAL1和OsPAL2催化苯丙氨酸生成的t-CA进入木质素合成途径参与植物细胞壁的组成;OsPAL4催化生成的t-CA则用于SA的生物合成,并调控植物的抗病过程;而其他OsPALs则可同时作用于木质素与SA合成。另外,水稻中木质素合成途径与水杨酸合成途径之间可能存在拮抗关系。
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