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胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)和诱导多潜能性干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)为基因修饰以及基因治疗提供了一种新型的研究工具。将基因修正后的人类多潜能性干细胞细胞经过自体移植,可实现某些遗传疾病治疗的目的。我室一直致力于杜氏肌营养不良(DMD)及血友病A的基因治疗研究。作为基因治疗的靶细胞,解决iPS细胞的来源是进行后续研究得以顺利开展的基础。本研究第一章内容拟将病人来源的尿液细胞诱导为iPS细胞,为后续DMD病人的自体化基因治疗提供合适的细胞来源。第二章研究内容拟利用我室之前建立的定点整合hFⅧ的人胚胎干细胞细胞株ET5作为研究对象,初步建立hESCs向限定性内胚层细胞(Definitive endoderm cells, DECs)分化的技术平台,从而为后续血友病A的治疗中肝细胞的来源提供一种解决思路。第一章：DMD病人尿液细胞向iPSCs的诱导与初步鉴定。目的：利用DMD病人尿液来源的细胞获得病人特异性iPSCs。方法：1.收集DMD基因50号外显子缺失的DMD病人尿液,分离并培养尿液细胞中肾小管上皮细胞。2.利用逆转录病毒将Oct4,Sox2, c-Myc和Klf4四种转录因子导入尿液细胞,经过20天左右的诱导,获得形态与hESCs细胞系高度相似的细胞克隆。3.对所得的细胞克隆进行多潜能性干细胞的表面标志物、碱性磷酸酶、细胞核型及体外随机分化的鉴定。结果：1.经上述方法诱导可获得尿液细胞来源的iPSCs样细胞系,MLPA检测诱导后iPSCs基因组DMD基因50号外显子缺失；2.诱导iPSCs细胞碱性磷酸酶染色阳性,且干细胞表面标志物表达与hESCs一致；细胞染色体核型显示无染色体水平的畸变；体外EB形成检测诱导的iPSCs可分化出表达内、中胚层特异标志物的细胞。结论：建立了DMD基因50号外显子缺失的iPS细胞系。第二章：hESCs向限定性内胚层细胞的诱导分化。目的：初步建立hESCs定向限定性内胚层细胞诱导分化以及鉴定的技术平台。方法：1.联合BMP4、Activin A、chir99021诱导ET5向限定性内胚层细胞分化；2.分化过程的第一天和第五天抽提分化细胞的RNA, RT-PCR检测内胚层标志基因Sox17, FoxA2的表达情况；3.分化五天后流式分析DE细胞表面特异标志物c-kit(CD117)、CXCR4(CD184)的表达。结果：1.联合高浓度Activin A、BMP4、chir99021对ET5诱导5天,分化第二天即可在ET5克隆中观察到上皮样细胞的出现。2.分别抽提分化过程当中第一天和第五天的细胞的RNA, RT-PCR分析可检测到Sox17, FoxA2的表达。3.诱导五天后,流式分析DE细胞表面共表达c-kit、CXCR4阳性率达到39.01%。结论：初步建立hESCs向限定性内胚层细胞分化的方法。