脊椎动物MHC基因是与机体免疫应答密切相关的多基因家族,其表达产物通常具有高度的多态性,这种多态性赋予动物更为广泛的抗原识别与结合能力,因而被认为是研究脊椎研究动物适应性进化过程的最佳候选基因。MHC基因多态性受种群历史、统计学参数、瓶颈效应、环境病原体种类与丰度、行为及生态等多种因素影响。病原体介导的平衡选择被认为是维持MHC基因多态性的主要机制。麂属动物的黑麂(Muntiacus crinifrons)和黄麂(Muntiacus reevesi)在染色体组成、核型特征、进化历史、地理分布以及种群数量等方面均存在显著差异。本文以皖南同域分布的黑麂和黄麂为研究对象,通过比较这两种动物MHC-DR基因的组成及其多态性,探讨麂属动物DR基因多态性的一般特征及其维持机制。研究结果为揭示鹿科动物DR基因进化机制提供来自麂属动物的证据,同时为我国特有的濒危野生动物——黑麂保护策略的制定提供来自功能基因的依据奠定基础。本研究分为两个部分,首先,通过近缘种牛科动物DRB基因引物对目标物种进行群体扩增,初步获得DRB基因多态性概括。在此基础上,利用磁珠杂交富集法从血液 cDNA中分离目标物种的全长DR基因表达序列,通过分析序列特征结合同源序列比较确定每个物种表达的DR基因座位数目,并探讨其系统发育地位。主要结果如下:　　1.利用牛DRB3 exon2特异性引物(LA31/LA32)对黑麂和黄麂黄山种群进行群体扩增和克隆测序,初步检测这两种动物 DRB基因 exon2等位基因多态性。结果从黒麂24个样品中共获得22个等位基因,从22个黄麂样品中获得到26个等位基因。所有序列均不包含插入或缺失突变,也没有检测到提前终止密码子,因此推测,本研究利用跨物种引物扩增出来的DRB基因序列均来自表达的功能基因;此外,两个物种每个样品均包含2~5个等位基因数,暗示这两个物种均至少拥有3个不同的DRB基因座位。　　2.两种动物DRB基因 exon2抗原结合区序列的非同义替换(dN)均显著大于同义替换(dS)(P<0.05),暗示历史上黑麂和黄麂DRB基因经历过正选择作用。利用CODEML程序中的模型M1与M2, M7与M8对上述序列受正选择位点进行检测,模型M2和M8的BEB均一致地检测到10个位点(10 Y**,11T**,13 S**,61 W**,67F**,71R**,74E**,78V**,86V**,90T**)受正选择作用的氨基酸位点,进一步佐证黑麂和黄麂DRB在进化过程中经历了明显的正选择作用。　　3.利用邻接法中的Kimura双参数模型(Kimura2-parameter model)构建了黑麂和黄麂DRB基因外显子2等位基因序列间的系统发生关系。结果表明,黑麂和黄麂DRB基因外显子2等位基因呈镶嵌式排列,暗示跨物种进化是维持这两个物种DRB基因多态性的一个重要机制。此外,从NJ树的拓扑结构来看,这两个物种DRB基因 exon2的所有等位基因分属4个不同的谱系,间接表明黑麂和黄麂DRB基因可能拥有4个不同的座位。　　综合1-3的结果表明,黑麂和黄麂虽然在进化历史、地理和生态分布等方面存在显著差异,但这两个物种同域分布的黄山种群DRB基因exon2多态性相差不大。正选择和跨物种进化是维持这两种动物DRB基因多态性的重要机制。　　4.利用磁珠杂交富集法,从黑麂血液cDNA样品中共获得1条DRA和5条DRB基因cDNA序列;从黄麂血液样品中获得2条DRA和4条DRB基因cDNA序列。除黑麂的1条DRB序列丢失了5’UTR和exon1以外,其它DR cDNA序列均为包含部分5’UTR、完整CDS和3’UTR的全长cDNA序列。序列特征和同源比较分析,结合系统发生关系分析结果表明,黑麂DRA基因呈单态,而黄麂DRA具有多态性;黑麂5条DRB序列分别代表4个不同的座位,而黄麂4条序列代表3个不同的座位;而且,黑麂和黄麂至少各有一个DRB基因具有多态性。　　5.基于全长cDNA序列,利用邻接法和贝叶斯法(BI)构建了包含牛、羊等部分其它哺乳动物同源序列的系统发生树。相对非反刍类而言,NJ和BI树均支持反刍类 DRA和 DRB基因分别构成独立的进化支,享有共同的祖先谱系。在反刍类DRA进化支内,鹿科和牛科动物DRA基因分别聚类,表明DRA基因在同一类群内(科级分类单元)高度保守。在反刍类DRB基因进化支内,牛科所有DRB基因也构成一个独立的谱系,但谱系同时包括黑麂的 Mucr-DRB4基因;黑麂其它3个DRB座位与黄麂的3个座位分属3个不同的谱系,并且具有一一对应的关系。　　综合4-5的研究结果表明,黄麂和黑麂DRA均只有一个基因座位,但黄麂DRA基因具有多态性;黄麂和黑麂分别拥有3-4个表达的DRB基因座位,且至少各有1个具有多态性。黑麂的4个DRB座位中,1个与牛科动物DRB3享有共同的谱系关系,其余3个座位分别与黄麂相应的座位享有共同的进化关系。