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Centromere protein F(CENPF)是一个含有亮氨酸拉链及卷曲螺旋结构域的动粒蛋白,属于着丝粒蛋白家族成员。同时CENPF也是一个多功能蛋白,在有丝分裂中对细胞增殖、囊泡运输及细胞形变等过程具有重要的调控作用,这些功能的发挥依赖于CENPF跟微管蛋白(Microtubule,MT)的相互作用。然而,目前对于CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中的功能所知甚少。因此,我们的研究将重点对CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中的功能进行详细探讨。在第一部分(第二章)研究中,我们对CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂中的功能进行了研究。首先探讨了 CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂各个时期的蛋白表达及亚细胞定位情况,对CENPF在卵母细胞中的定位机理进行了初步探讨。其次,利用Cenpf特异性的siRNA及Morpholino(MO)对CENPF表达进行敲减,进一步研究CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂中的功能。最后,对CENPF调控小鼠卵母细胞减数分裂过程潜在的作用机理进行了研究。在本章研究中,收取GV、GVBD、MI、AI-TⅠ及MⅡ期卵母细胞,利用免疫印迹及免疫荧光技术对CENPF进行蛋白定量及定位研究。免疫印迹结果显示,CENPF在减数分裂的各个时期均有表达,在GV期表达量较低,在减数分裂中期(MⅠ期及MⅡ期)表达量较高。免疫荧光结果显示,CENPF在GV期定位于细胞核的核膜。随着卵母细胞发生GVBD,CENPF开始定位于纺锤体,并持续到减数分裂结束,除TⅠ期外,CENPF还定位于着丝粒上。为了探究CENPF的定位机制,我们利用微管干扰药物Nocodazole(促进微管解聚)和Taxol(抑制微管解聚)处理MⅡ期卵母细胞,结果发现CENPF在纺锤体上的定位依赖于微管蛋白的稳定,在着丝粒上的定位则不依赖于微管蛋白。进一步利用法尼基转移酶抑制剂(Farnesyl Transferase Inhibitor,FTI)SCH66336 处理卵母细胞,发现CENPF在GV及MⅠ期的定位不依赖于自身的法尼基化,在MⅡ期的定位则依赖于自身的法尼基化。Cenpf-siRNA及CENPF-MO对CENPF功能干扰的实验结果表明,CENPF缺失会导致GVBD及第一极体排放(First polar body extrusion,PBE)失败。TUBB及DNA免疫荧光染色结果显示,CENPF缺失导致纺锤体组装缺陷及染色体中期板集合失败。eGFP-TUBB及mCherry-H2B实时观察结果进一步表明,CENPF缺失后,纺锤体组装失败,染色体无法正确排列到中期板,进而导致减数分裂失败。染色体铺片结果显示,CENPF缺失导致MⅡ期卵母细胞染色体的异倍性显著升高。对减数分裂失败并停滞在MⅠ期的卵母细胞研究发现,虽然染色体稳定性暂时没有受到影响,但因为姐妹染色单体着丝粒间距变宽,从而有可能导致后期染色体异倍性发生的概率增加。最后,通过CREST及TUBB免疫荧光染色发现,CENPF缺失导致微管-动粒连接缺陷,染色体无法被微管蛋白抓取。同时CENPF缺失导致纺锤体组装检验点(Spindle Assembly Checkpoint,SAC)相关蛋白Mad1及Mad2激活,从而导致中后期转换受到抑制。综上所述,CENPF缺失导致微管组装及微管对动粒捕捉失败,最终导致SAC持续激活。由于SAC处于激活状态,一部分卵母细胞无法完成减数分裂中后期转换,最终导致卵母细胞成熟失败。而对于部分"逃离"SAC监控的卵母细胞,虽能完成减数分裂,但由于纺锤体组装异常,且微管-着丝粒连接不稳定,染色体无法正常分离,最终导致这部分MⅡ期卵母细胞形成异倍体的概率增加。在第二部分(第三章)研究中,我们对CENPF在小鼠早期胚胎发育过程中的作用进行了详细探究。首先,探讨了 CENPF在小鼠早期胚胎各个时期的蛋白表达及亚细胞定位情况,对CENPF在早期胚胎的定位机理进行了初步探讨。其次,在MⅡ、PN及2-cell期注射CENPF-MO,进一步研究CENPF敲减对早期胚胎发育的影响。收取受精后 AⅡ-TⅡ、PN、Late 1-cell、2-cell、4-cell、8-cell、桑葚及囊胚期胚胎,利用免疫印迹及免疫荧光技术进行CENPF蛋白定量及定位研究。免疫印迹结果显示,CENPF在早期胚胎发育的各个时期均有表达,从8-cell开始蛋白表达量逐渐减少。免疫荧光结果显示,在有丝分裂间期,CENPF定位于核膜及细胞间桥部位。进入分裂期,CENPF定位于纺锤体或者着丝粒上。我们利用FTⅠSCH66336处理PN期胚胎,发现CENPF在桑葚胚及囊胚中定位消失,说明在早期胚胎发育过程中,CENPF的定位同样依赖于自身的法尼基化。MⅡ期卵母细胞注射CENPF-MO后孤雌激活,观察胚胎发育情况。结果显示CENPF敲减导致早期胚胎发育失败,胚胎发育阻滞在4-cell或8-cell期,几乎无囊胚形成。PN期胚胎敲减CENPF的结果与MⅡ期卵母细胞敲减结果一致。为了更直观地观察CENPF敲减对早期胚胎发育的影响,将带有红色荧光基团的Ctrl-MO及带有绿色荧光基团的CENPF-MO分别注射到一个2-cell的两个卵裂球中,进行活细胞实时观察。结果表明,注射Ctrl-MO的卵裂球最终发育成囊胚,而注射CENPF-MO的卵裂球则无法形成囊胚。综上所述,CENPF在小鼠卵母细胞减数分裂及早期胚胎发育过程中发挥了重要作用。