化石燃料,包括石油、煤炭、天然气是当今世界上应用最广泛的能源物质。特别是石油,它与工业生产密切相关,紧密联系着世界工业经济命脉,因此被誉为“工业的血液”。生活中的各个领域中都离不开化石燃料。由于其特殊的成因和结构,化石燃料中几乎普遍含有硫元素,无机硫大多数以元素硫、硫铁矿FeS2形式存在,有机硫包括硫醇、硫醚、噻吩和其他结构更复杂的杂环化合物。化石燃料在使用过程中,其中所含的硫以各种形式排放到环境中,造成严重污染和破坏。所以,高硫燃料必须经过脱硫处理后才能被使用,对燃料进行一定深度的脱硫处理,是当今化石燃料应用过程中面临的一大难题,研究开发经济有效的脱硫技术已成为化石燃料工业最紧迫的任务之一,它对提高燃料利用率、降低加工成本、改善生态环境等都具有极其重要的意义。从2000年夏天起,我国开始实施新的燃油标准。新标准的规定,汽油中硫的含量不得超过800 mg/L。此项标准自2000年7月1日首先在北京、广州和上海三个城市实施,到2003年1月1日,国内其它地区开始执行。与旧标准中1200 mg/L的硫含量值相比,新标准更加严格。柴油中的硫化物燃烧后生成硫氧化物,造成酸雨等系列环境问题,已经引起了世界各国政府的重视,很多国家都在努力通过技术革新、工艺改进来降低燃料中的硫含量。典型原油的硫含量在1.0×103～3.0×103 mg/L之间,典型柴油的硫含量约为5×103 mg/L。经过近几十年的技术改进,成品柴油的硫含量已经从5×103 mg/L降低到了500 mg/L,在2005～2007年之间,柴油中硫的含量将降低到10～15 mg/L。传统的加氢脱硫(hydrodesulfurization,简称HDS)技术能有效的降低馏分油中的硫含量。但是HDS技术是一项在高温(>300℃)、高压(>100 atm)下进行的脱硫技术,对于硫化物、硫醇、硫醚中的硫都能有效的脱除,最终把硫原子转化为H2S和/或结构更复杂的有机硫化物。HDS要脱除二苯并噻吩(dibenzothiophene,简称DBT)、苯并噻吩(benzothiophene,简称BT)、噻吩(thiophene,简称T)及相应衍生物中的硫,需要强化操作条件,从操作成本上不可行,而且会降低燃料的燃烧值。近些年,对生物催化脱硫(biocatalysis desulfurization,简称BDS)技术的研究开发取得了很大进展。BDS技术是在常温常压下利用专一性微生物产生的酶催化杂环上特定的“C-S”键的断键反应,释放出可溶性硫而保持碳氢化合物骨架不被破坏。BDS技术在满足脱硫要求的同时,不降低燃料的热值,而且不需要高成本的氢气,节约了能源,同时减少了二氧化碳的排放量,对环境保护极为有利。因此,BDS技术是一种很有开发前景的脱硫方法。本课题的研究内容是,选取DBT为柴油中含硫杂环化合物的模型化合物,从长期被石油污染的土壤中分离出13株专一性脱硫菌YZ-1～YZ-13。DBT被脱硫菌株以微生物脱硫的“4S”途径代谢后,生成2-羟基联苯(2-hydroxybiphenyl,简称2-HBP)和硫酸盐,2-HBP与Gibb`s试剂显色反应为蓝色衍生物,以蓝色衍生物的吸光度值为定量依据,考察菌株对DBT的脱硫能力。试验中发现YZ-9的脱硫活性比较稳定,因此,将YZ-9进一步分离鉴定,以DBT为唯一硫源培养,考察该菌株对不同浓度DBT的脱硫能力,并对YZ-9的发酵条件进行了优化。然后,将YZ-9接种到广州石化直馏柴油中,考察该YZ-9活细胞对成品柴油的脱硫效果。最后,将YZ-9制成休止细胞,考察不同浓度的休止细胞对DBT和柴油的脱硫效果。实验具体分以下几部分展开:(1)菌种筛选,以被石油组分污染的土壤样品为菌源,采用两种方式筛菌。一种方式是,以无机硫(Na2SO4)、有机硫(DMSO)、杂环硫(thiophene)、模型化合物DBT为唯一硫源,隔24 h依次转接培养土样中的混合菌,逐渐驯化菌株并增强脱硫菌株的脱硫能力,经稀释涂平板纯化出8株专一性脱硫菌YZ-1～YZ-8。转接培养时发现YZ-1～YZ-8在含DBT的基础盐培养基(basic salt medium,简称BSMD)中脱硫能力表现不稳定。另一种筛选方式是,用含有1.0 mmol/L的DBT的BSMD作为选择培养基,以培养液离心上清液使Gibb`s试剂在碱性条件下变蓝为依据,筛选分离目的菌株。实验室筛选得到五株专一性脱硫菌,分别命名为YZ-9～YZ-13,转接培养发现YZ-9对模型化合物DBT的脱硫能力表现更稳定,从而确定YZ-9为实验菌株,对其进行生理生化鉴定,鉴定结果表明YZ-9为红球菌属。(2)YZ-9发酵条件考察,微生物体内产生的特定酶,具有高度的底物选择性和反应类型专一性,酶的浓度和酶的催化活性与菌体的浓度有关,也与菌株的生长环境中的其他影响因素有关。因此,对YZ-9的最适生长条件进行了考察。将对数生长期末期种子液以5%体积比,接种到初始DBT浓度为0.5 mmol/L的新鲜的BSMD培养基中,通过菌体浓度和DBT脱除率的高低,考察碳源、氮源、硫源、pH值、温度等影响因素对菌株生长状况和脱硫效果的影响。在分别以5.0 g/L葡萄糖、甘油、蔗糖、乙醇、柠檬酸等为碳源对比培养时,确定甘油为最适碳源。采用硝酸铵和氯化铵作为氮源对比培养考察时,确定氯化铵为最适碳源。以硫酸镁、二甲基亚砜、噻吩和DBT为培养硫源,考察了YZ-9的生长情况和脱硫效果,结果表明,以DBT作为种子培养硫源的细胞,具有较高的脱硫活性,其它硫源培养的种子细胞在转接的BSMD中生长状况虽然较好,但脱硫活性相对较低。用以上优化的培养基,考察液体发酵的初始pH值和培养温度,确定出最佳pH值在7.0～8.0之间,温度为30～35℃。进一步通过正交实验,确定出培养基配方和最佳液体发酵条件。试验确定培养基配方为(g/L):KH2PO42.44、Na2HPO4?12H2O 14.04、MnCl2 0.2、NH4Cl 2.0、CaCl2 0.02、FeCl3?6H2O 0.001、NaCl 0.01、甘油6.5、微量元素溶液母液3.0 ml/L、维生素溶液母液1.0 ml/L,发酵pH值为7.0。在优化的培养条件下培养YZ-9,用对数生长期末期菌液,考察了在不同DBT浓度梯度下的脱硫效率和柴油脱硫效果。(3)YZ-9活细胞对DBT脱硫能力考察,专一性脱硫菌YZ-9将模型化合物DBT代谢生成2-HBP,催化反应发生在“C-S”键,使“C-S”键断开,而保持“C-C”键不被破坏。DBT经过微生物特定酶的催化,依次生成3个代谢产物DBTO、DBTO2和2-HBP(“4S”),硫原子被转移到水溶性的SO42-中。试验中用气相色谱质谱联用仪测定发酵产物,发现了DBTO2和2-HBP的存在,说明该菌株的代谢途径为“4S”代谢途径。发酵过程中,DBT代谢终产物2-HBP的浓度和DBT自身的初始浓度,对菌株的脱硫效率都有一定程度的影响。Gibb`s试剂和2-HBP在碱性条件下生成蓝色的络合物,在610 nm处的吸光度值与2-HBP质量浓度之间存在线性关系,用于定量确定发酵液中生成的2-HBP的浓度,从而计算出DBT的降解率。实验确定菌株的有效脱硫浓度为0.5～1.0 mmol/L,此时的脱硫率为60%以上,菌株对DBT的耐受能范围为1.5～2.0 mmol/ L。(4)YZ-9活细胞柴油脱硫试验,筛选培养菌种的最终目的是将菌种用于柴油的生物催化脱硫,选择含硫量为600～700 mg/L的广州石化直馏柴油作为处理对象,考察菌株的脱硫能力。实验中,通过YZ-9对油水体积比为1:3、1:4、1:5、1:6的比例培养120 h,微库伦仪测定培养后的硫含量,采用工业乙醇为破乳剂,测定结果表明,油水比体积为1:6时的脱硫效果最好,脱硫率为19.25%。(5)YZ-9休止细胞对DBT脱硫率考察,用YZ-9对数生长末期离心分离收获的菌体,作为休止细胞配成不同浓度的菌悬液,考察休止细胞2 h对DBT的脱除效果,结果表明,在DBT初始浓度为2.0 mmol/L的BSMD培养基中,以10%体积比接种,休止细胞浓度为3.0 g/L时比脱硫活力最大为0.48μmmolg-1min-1。以3.0 g/L的休止细胞浓度考察休止细胞对不同浓度的DBT的脱除率,结果显示,DBT初始浓度越高,脱除率越低,对0.5 mmol/L的脱除率最高达到83.2%,对1.0、1.5、2.5 mmol/L的DBT的脱除率分别为78.4%、64.2%和53.1%。(6)YZ-9休止细胞对柴油脱硫能力考察。将休止细胞与柴油混合振荡反应12 h考察柴油脱硫率,油水体积比为1:6,休止细胞体积分数为10%,柴油脱硫试验结果表明,休止细胞浓度为5.0和6.0 g/L时的柴油脱硫效果最好,脱硫率分别达到25.7%和24.6%。从实验结果可以看出,YZ-9是一株优良的菌株,该菌株产生的酶能有效的脱除DBT和柴油中的硫,实验室选的柴油是直馏柴油,该菌株有希望用于加氢脱硫后的补充脱硫工艺的开发研究,具有进一步研究的价值。