前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,也是全球第二大最常见的男性癌症。几乎所有晚期PCa患者在接受内分泌治疗后都会发展成去势抵抗性前列腺癌。尽管雄激素受体是治疗转移性去势抵抗性前列腺癌(metastatic castrate-resistant prostate cancer,mCRPC)的有效方法,但2018年美国依然有29430人死于PCa。近年来对14-3-3蛋白家族的研究发现,该家族成员14-3-3ε在前列腺癌的发生发展中发挥了重要作用,可能成为前列腺癌诊断治疗的分子靶点。同样,大量研究也证实miRNAs在前列腺癌的发生发展中同样发挥了重要作用,在前列腺癌的分子诊断和靶向治疗方面同样具有广阔的应用前景,然而miRNAs调控14-3-3ε在前列腺癌发生发展中的具体分子机制尚不清楚。本研究采用UALCAN-TCGA在线数据库结合qRT-PCR、CCK-8、细胞划痕、Transwell、双荧光素酶系统、流式细胞术等试验手段,从细胞水平和分子水平,阐明miRNAs调控14-3-3影响前列腺癌细胞增殖凋亡的分子机制。相关研究可为前列腺癌的分子诊断和靶向抗癌药物研发提供新思路。主要研究结果如下:1.14-3-3ε在PCa组织和细胞中的表达及其对22Rv1细胞增殖的影响UALCAN-TCGA数据库分析结果表明,14-3-3蛋白不同亚型在PCa组织和癌旁组织具有不同的表达模式,其中14-3-3ε/YWHAE、14-3-3γ/YWHAG和14-3-3τ/YWHAQ在PCa组织中表达上调,14-3-3η/YWHAH、14-3-3β/YWHAB和14-3-3ζ/YWHAZ在PCa组织中表达下调;在前列腺癌不同细胞系中的研究发现,14-3-3ε在PC3、22Rv1、LNCaP中具有同PCa组织中相同的表达模式。CCK-8细胞增殖试验、细胞划痕试验和Transwell试验结果表明,干扰14-3-3ε的表达,严重影响了22Rv1细胞的增殖能力、迁移能力和侵袭能力(P<0.01)。以上结果暗示14-3-3ε在PCa中可能扮演原癌基因的角色。2.调控14-3-3ε表达的microRNAs筛选及功能验证TargetScan、miRSystem、miRanda和PicTar等在线软件预测发现,miR-155-5p、miR-31-5p、miR-29b-3p、miR-29a-3p及miR-29c-3p是调控14-3-3?得分最高的5条miRNAs;综合qRT-PCR试验、双荧光素酶试验和CCK-8试验结果发现,在22Rv1细胞中miR-31-5p与14-3-3?具有逆向表达关系,是调控14-3-3?表达效率最高的miRNA。通过构建野生型和突变型荧光素酶载体,我们发现:14-3-3?3’UTR中“UCUUGCC”7个碱基位点是miR-31-5p调控14-3-3?表达的特异性功能靶点,该位点的缺失,严重影响了miR-31-5p对14-3-3?基因的调控能力。3.miR-31-5p调控14-3-3ε对22Rv1细胞表型的影响CCK-8试验、细胞划痕试验、Transwell试验结果发现:mi R-31-5p过表达,严重影响了22Rv1细胞增殖、迁移和侵袭能力;流式细胞试验发现:miR-31-5p的上调直接导致22Rv1细胞停滞在G1期,间接抑制了22Rv1细胞增殖;细胞凋亡试验结果发现:miR-31-5p的上调促进了22Rv1细胞的早期凋亡和细胞坏死。补偿试验结果发现,miR-31-5p与14-3-3?共转染,部分逆转了miR-31-5p对22Rv1细胞增殖、迁移和侵袭能力,同时也部分逆转了miR-31-5p对22Rv1细胞周期的抑制和对22Rv1细胞的促凋亡能力。4.miR-31-5p调控14-3-3?对PI3K/Akt/Bcl-2信号通路的影响对miR-31-5p调控14-3-3?影响22Rv1增殖凋亡的信号通路研究发现,miR-31-5p的上调,显著下调了p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的比值,上调了Bad、Bax/Bcl-2的表达水平,激活了caspase-9和caspase-3等与细胞凋亡相关的级联反应;然而,miR-31-5p与14-3-3?共转染,部分逆转了这一现象。以上结果暗示miR-31-5p靶向调控14-3-3?抑制22Rv1细胞增殖和促进细胞凋亡是通过调节PI3K/AKT/Bcl-2信号通路实现的。综上所述,本文明确了14-3-3?蛋白在前列腺癌组织和细胞中显著升高,发现miR-31-5p是靶向调控14-3-3?基因表达的最佳miRNAs,解析了miR-31-5p靶向调控14-3-3?与22Rv1细胞增殖凋亡的关联性,阐明了miR-31-5p靶向调控14-3-3?影响22Rv1细胞增殖凋亡的分子机制。为miR-31-5p和14-3-3ε联合应用于CRPC精准治疗提供了新的理论依据。