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猪链球菌病是由猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)引起的一种当前严重危害我国养猪业的重要细菌性传染病。根据荚膜多糖抗原成分不同,猪链球菌分33个血清型(1-31、33、35型和1/2型)。其中猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)作为一种重要人畜共患传染病病原,不仅影响着养殖业的健康发展,还严重危害着人类的健康,引起了社会的高度关注。近几年,SS2已成为国内外研究的热点,尤其是关于其分子致病与免疫机理方面的研究。病原微生物致病由多种毒力因子的协同作用而引起,这些毒力因子受某些调控系统的调控,形成一个复杂的调控网络。双组分调控系统(Two-Component Regulatory System,TCS)是广泛存在于细菌中的一种信号转导机制。它首先感应外界环境的变化,继而把信息传给内部系统,导致细菌毒力因子等表达发生变化。大量研究证实,TCS参与调控细菌致病性、生长代谢、营养代谢、耐药性及毒力因子的表达等多种生物学功能。随着我国猪链球2型05ZYH33和98HAH12菌株全基因组测序的完成,在SS2发现至少有15对双组分调控系统。然而,在这些调控系统仅SalK-SalR和两个“孤儿”调控因子RevS.CovR被研究报道。本论文选取了其中一对双组分调控系统1910HK/RR为研究对象,开展了一系列生物学研究,以探讨其与SS2野生菌株SC19(WT)致病性的关系。主要研究内容包括：1.基因缺失突变株Δ1910hk/rr和互补菌株CΔ1910hk/rr的构建及鉴定参考SS2强致病株05ZYH33全基因组序列,设计引物,以四川分离的WT为亲本株,提取其基因组DNA为模板,PCR分别扩增基因1910hk/rr上下游同源臂、开放阅读框(ORF)和全长序列,利用温度敏感型“自杀性”质粒pSET4s,构建重组转移质粒pSET4s-1910hk/rr。将重组转移质粒电转化到WT感受态细胞中,通过28℃和37℃温度双标记和抗生素筛选,初步获得1910hk/rr基因缺失菌株。应用PCR、RT-PCR和测序对突变株进一步鉴定,成功构建基因缺失突变株Δ1910hk/rr。利用穿梭质粒pAT18,将所缺失的基因1910hk/rr及其启动子序列一起转入相应的基因缺失突变菌株Δ1910hk/rr中,通过PCR和RT-PCR鉴定,获得了相应的互补菌株CΔ1910hk/rr。2.WT、Δ1910hk/rr和CΔ1910hk/rr的体外生物学特性比较研究在体外相同培养条件下,开展了WT、Δ1910hk/rr和CΔ1910hk/rr体外生物学特性比较研究。结果表明：Δ1910hk/rr的生长速率要低于WT和CΔ1910hk/rr。透射电镜结果显示,Δ1910hk/rr形态结构未发生改变。定性和定量的溶血性试验结果表明,与WT相比,Δ1910hk/rr的细菌溶血活性并没有发生显著变化。中性粒细胞(PMN)介导的杀伤实验结果显示,双组分调控系统1910HK/RR缺失后使得SS2抵抗中性粒细胞(PMN)的杀伤能力降低。体外细胞粘附和侵染试验结果表明,Δ1910hk/rr对HEp-2细胞的粘附和侵染能力降低,但是粘附能力下降更为显著。3.双组分1910HK/RR缺失后对SS2致病性的影响为了进一步评价双组分调控系统1910HK/RR对SS2致病性的影响,在CD-1小鼠和断奶仔猪身上开展了动物实验。分别用菌株WT、Δ1910hk/rr和CΔ1910hk/rr感染CD-1小鼠。半数致死量(LD5o)结果为,Δ1910hk/rr为1.22×109CFU,而WT为4.14×107CFU野毒菌株,突变株是野生菌株的29.5倍,Δ1910hk/rr的毒力与WT相比下降非常显著。发病率和存活率试验：参考小鼠半数致死量的结果,采用了108CFU的剂量来进行试验。分别用Δ1910hk/rr、CΔ1910hk/rr和WT感染小鼠,观察12 d。其结果为：与WT相比,Δ1910hk/rr发病率降低,死亡率为10%,感染后小鼠脑和肺组织无明显的病理损伤。WT与CΔ1910hk/rr的死亡率分别为70%和80%。组织器官载菌量结果显示,Δ1910hk/rr感染组小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、血等组织活菌数都要低于WT。进一步以105CFU剂量感染5周龄左右断奶仔猪。结果为：感染后48 h内WT组死亡率为66.7%(4/6)；存活的2头仔猪也出现典型的症状,而Δ1910hk/rr组观察到21d,死亡率为16.7%(1/6)：心、肝、脾、肺、肾、脑、血液、关节等组织载菌量比较分析发现,Δ1910hk/rr组也低于WT组。以上结果说明,双组分1910HK/RR缺失后SS2的致病性明显降低。4.双组分调控系统1910HK/RR调控SS2致病性机制的初步研究为了探讨双组分调控系统1910HK/RR调控SS2致病性的可能分子机制,首先,通过基因表达谱芯片片,开展了Δ1910hk/rr与WT差异表达基因分析。结果显示：在整个基因组2194个基因中,Δ1910hk/rr有219个基因转录水平发生了变化,占整个SS2基因组9.98%。其中105个基因下调表达1.5倍以上,114个基因上调1.5倍以上。有50个基因表达下调2倍以上,32个基因表达上调2倍以上。选取与氨基酸转运、代谢、毒力、荚膜合成等相关的24下调表达的基因进行荧光定量PCR验证,其结果也全部下调,证实了芯片结果的可信性。为了研究1910HK/RR与唾液酸合成相关的4个基因(NeuB.NeuC.NeuD.NeuA)的结合特性,克隆、表达并纯化双组分调控系统1910HK/RR的反应调控蛋白1910RR,经EMSA证实,唾液酸合成相关基因启动子能与1910RR结合,初步证实了唾液酸合成相关基因受1910HK/RR的调控。