血管过度生成是原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)生长、侵袭和转移的基础,可为肿瘤细胞提供充足的营养和排出代谢废物。肿瘤血管生成是一个复杂的过程,受多种基因、细胞因子及信号转导通路的协同调控。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前所知活性最强的促进血管生成的细胞因子,在肝癌细胞中过量表达,处于血管生成相关信号转导通路的核心地位,可作为肝癌治疗的靶标之-VEGF的过量表达还可影响免疫系统树突状细胞(dendritic cells, DCs)的成熟及功能。DCs是体内功能最强大的专职抗原提呈细胞,具有免疫监视作用,可活化初始性T细胞,并分泌不同的细胞因子,使辅助性T淋巴细胞(T helper lymphocytes, Th)向Thl或Th2方向分化,分别激发细胞免疫或体液免疫效应,与肝癌的发生、发展及预后关系密切。中草药南蛇藤(Celastrus orbiculatus thunb.,卫矛科,南蛇藤属)的应用在我国已有几千年的历史,主要用于抗风湿和其它抗炎治疗。本课题组前期研究显示,南蛇藤茎乙酸乙酯提取物(C. orbiculatus ethyl acetate extracts, COE)具有抗肿瘤的生物学活性,但其作用机制还未完全揭示。本研究首次对COE抗肝癌血管生成的机制进行研究,结果证实,COE促进小鼠肝癌细胞Hepal-6的早期凋亡,通过抑制Hepa1-6细胞中VEGF mRNA的转录降低VEGF蛋白的表达。同时,COE抑制人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)形成网络样毛细血管丛。分离正常C57BL/6小鼠骨髓CD11c+DCs,以不同浓度(10,20,40,80或160μg/mL)的COE对其成熟过程进行干预,研究COE是否影响DCs的成熟和功能。结果表明COE明显增加DCs表面共刺激分子、MHC分子及趋化因子的表达量,促进DCs的分化和成熟。同时,COE促进DCs分泌Thl类细胞因子,增强DCs活化T细胞的功能。体内研究显示,COE抑制C57BL/6小鼠Hepal-6细胞移植瘤的生长,降低血清VEGF浓度,减少移植瘤内VEGF的表达和微血管密度。COE促进荷瘤小鼠体内DCs的成熟,增加肿瘤特异性CD8+T细胞的数目。综上,一方面,COE降低肝癌血管生成,抑制移植瘤生长；另一方面,COE促进DCs的成熟,增强DCs激活T细胞的功能,提高机体的抗肿瘤免疫能力。本研究为南蛇藤茎乙酸乙酯提取物的深入研究提供了一定的理论和科学实验依据,也为肝癌的治疗带来新的思路。研究共分为三部分内容。第一部分南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成的体外研究目的：研究COE对小鼠肝癌细胞Hepa1-6的增殖、凋亡及VEGF表达水平的影响,并观察COE能否抑制原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)形成网络样毛细血管丛,初步探讨COE抗肿瘤血管生成的机制。方法：MTT法观察不同浓度(10,20,40,80及160μg/ml)的COE对Hepal-6细胞增殖能力的影响。Hepa1-6细胞经不同浓度(10,20,40,80及160μg/mL)的COE处理后,标记Annexin V/PI,流式细胞术检测凋亡的细胞,酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定细胞培养上清中VEGF的浓度,并进一步用细胞免疫组化、 Western Blot及半定量RT-PCR的方法检测Hepa1-6细胞中VEGF蛋白及mRNA的表达量。在Matrigel基质胶上三维培养HUVECs,加入不同浓度(10,20,40,80及160μg/mL)的COE,光学显微镜观察COE对HUVECs血管生成拟态的影响。结果：药物作用48h,10,20,40,80及160μg/mL COE对Hepal-6细胞的增殖抑制率分别为7.51±0.73%,23.39±1.02%,36.64±2.13%,41.16±3.15%及52.47±3.23%,呈明显的时间剂量依赖性,与对照组5.28±0.69%相比,均显示显著差异(P<0.01)。根据COE对Hepa1-6细胞增殖的抑制率,计算COE的半数抑制浓度(50%concentration of inhibition, IC50)为120.998μg/mL不同浓度(10,20,40,80及160μg/mL) COE作用12h后,早期凋亡的细胞(Annexin V+PI-,Q4象限)数目分别为12.0±2.3%,13.9±1.5%,15.3±2.8%,17.2±3.4%及21.7±5.6%,与阴性对照组5.2±1.7%相比,具有显著差异(P<0.05或P<0.01)。结果说明COE诱导Hepa1-6细胞的早期凋亡,并呈剂量依赖性。对数生长期Hepal-6细胞在无血清培养基中孵育12h,加入不同浓度(10,20,40,80和160μg/mL)的COE作用16h后,用细胞免疫组化的方法,以抗鼠VEGF多克隆抗体检测Hepa1-6细胞中VEGF的表达量。结果显示,与对照组相比,COE的浓度超过40μg/mL时,可明显抑制Hepa1-6细胞中VEGF蛋白的表达量(P<0.01)。ELISA检测细胞培养上清中的VEGF表达水平,结果显示COE浓度大于40μg/mL可明显抑制VEGF蛋白的表达(P<0.01)。半定量RT-PCR法进一步分析COE对VEGF mRNA的影响,结果发现COE明显抑制VEGF mRNA的表达水平,其抑制作用呈剂量依赖性。综合分析上述结果,COE可以抑制小鼠肝癌细胞Hepal-6中VEGF的表达水平,且其机制为通过抑制VEGF mRNA的转录进而抑制VEGF蛋白的翻译过程。HUVECs接种于Matrigel基质胶上,不同浓度(10,20,40,80及160μg/mL)COE作用18h。镜下显示,10μg/mL COE组,HUVECs网状毛细血管管腔数目(78±12)与阴性对照组(84±17)没有明显差异(P>0.05)。20μg/mL COE组,网状管腔数目为43±9,明显减少(P<0.01)；80μg/mL COE组,部分HUVECs细胞能够形成梭状或长条状,但不能形成网状管腔(P<0.01)；COE浓度为160μg/mL时,几乎完全抑制HUVECs细胞形成血管管腔(P<0.01)。结论：南蛇藤提取物可抑制肝癌细胞增殖,促进肝癌细胞凋亡,下调肝癌细胞表达VEGF,抑制血管内皮细胞形成网络样毛细血管丛,进而抑制肝癌生长和血管生成。第二部分南蛇藤提取物促进树突状细胞成熟和功能的体外研究目的：体外观察COE对树突状细胞(dendritic cells,DCs)的成熟和功能的影响,探讨COE发挥免疫调节作用的机制。方法：分离正常C57BL/6小鼠胫骨和股骨的骨髓中的CDllc+DCs,以不同浓度(10,20,40,80及160μg/mL)的COE作用5d后,10ng/mL的LPS刺激DCs成熟,流式细胞术分析DCs表面分子,ELISA检测DCs培养上清中细胞因子的含量。混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction,MLR)分析COE对DCs活化T淋巴细胞能力的影响。结果：COE (10-160μg/mL)促进DCs表面共刺激分子(CD40,CD80和CD86)及MHC分子(H-2Kb和I-Ab)的表达,增加DCs趋化因子受体CCR7的表达量,增强DCs活化T淋巴细胞的能力,并呈剂量依赖性。20μg/mL COE组,DCs分泌IFN-y的浓度为983.9±25.9pg/mL,与对照组(745.3±18.5pg/mL)相比,有统计学意义(P<0.05)；40μg/mL COE组,IFN-y浓度为1060.2±43.8pg/mL,与对照组相比,有极显著差异(P<0.01)。10μg/mL和20μg/mL COE组,DCs分泌IL-2的浓度分别为176.1±13.9pg/mL和184.2士13.1pg/mL,与对照组112.8±16.1pg/mL相比有统计学意义(P<0.05)；40μg/mL COE组,IL-2浓度为208.0±12.3pg/mL,与对照组相比,有极显著差异(P<0.01)。10,20,40,80,160μg/mL COE组,DCs分泌IL-10的浓度分别为301.0±15.9pg/mL,233.2±24.7pg/mL(P<0.05),185.7±11.3pg/mL(P<0.05),157.6±21.8pg/mL (P<0.01),145.5±12.2pg/mL(P<0.01),与对照组349.7±17.3pg/mL相比,有统计学意义。10,20,40,80,160μg/mL COE组,DCs分泌IL-4的浓度分别为445.6±17.8pg/mL,424.5±15.6pg/mL(P<0.05),324.6±25.2pg/mL(P<0.05),179.8±17.0pg/mL(P<0.01),53.2±16.3pg/mL(P<0.01),与对照组558.9士11.7pg/mL相比,有统计学意义。经COE干预后,DCs活化T细胞能力增强,与对照组T淋巴细胞的增值率42.4±5.1%相比,10,20,40,80,160μg/mL COE组T淋巴细胞的增值率分别为45.0±1.3%(P=0.581),58.3±6.2%(P=0.005),63.6±6.1%(P=0.001),78.1±7.3%(P=0.000),105.0±5.7%(P=0.000)。结论：COE能促进DCs的成熟；增强DCs对淋巴细胞的趋化和活化作用；促进DCs分泌Thl类细胞因子(IFN-γ和IL-2),抑制DCs分泌Th2类细胞因子(IL-10和IL-4),可使Th细胞向Thl方向极化,具有明显的免疫调节的效果。第三部分南蛇藤提取物抑制肝癌血管生成及增强树突状细胞功能的体内研究目的：研究COE对C57BL/6小鼠Hepa1-6细胞肝癌移植瘤及血管生成的影响,同时分析COE能否增加成熟树突状细胞的数目,促进荷瘤小鼠的细胞免疫功能。方法：将60只C57BL/6小鼠据体重随机分为正常组、模型组(1％DMSO).阳性对照组(1mg/kg顺铂)及COE高、中、低剂量(40,20,10mg/kg)组,每组10只。除正常组外,于左前肢腋部皮下接种小鼠肝癌细胞株Hepa1-6(1×106)0.1mL/只。接种后2w,连续给药28d,末次药24h后,检测肿瘤体积及重量,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸盐缺口标记法(teirminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling assay,TUNEL)检测移植瘤组织内肿瘤细胞的凋亡,ELISA检测血清中VEGF的浓度,免疫组化检测移植瘤组织内微血管密度及VEGF的表达。流式细胞术分别检测荷瘤小鼠脾脏内成熟DCs(CD1lb+CD1lc+)及CD8+T细胞的数目。结果：与模型组平均瘤重1.08±0.10g相比,南蛇藤提取物中、低剂量组平均瘤重分别为0.69±0.10g和0.83±0.10g,均能有效抑制肿瘤生长(P<0.05),南蛇藤提取物高剂量组平均瘤重0.51±0.15g,明显抑制肿瘤生长(P<0.01),抑制作用具有剂量依赖性。肝癌移植瘤组织切片内,COE低剂量组平均凋亡细胞数为8.52±0.43,与模型组平均凋亡细胞数(6.36±0.69)相比,没有统计学差异；COE中、高剂量组及阳性对照顺铂组的平均凋亡细胞数分别是26.46±3.76,50.41±6.79和54.70±5.31,与模型组相比均有显著差异(P<0.01)。ELISA测得荷瘤小鼠血清VEGF浓度,COE低、中、高剂量组及阳性对照顺铂组分别为245.12±22.99pg/mL(P<0.05),72.08±16.97pg/mL(P<0.01),45.24±21.36pg/mL(P<0.01),70.22±29.59pg/mL(P<0.01),与模型组332.02±57.64pg/mL相比,均有统计学意义。肝癌移植瘤组织切片内VEGF的表达较模型组明显减少(P<0.05或P<0.01)。抗CD34特异性抗体对肿瘤组织微血管密度分析,COE低、中、高剂量组及顺铂组的MVD分别为14.33±1.69,11.18±1.35,6.76±1.48和6.85±1.14,与DMSO模型对照组的MVD值(16.43±2.53)相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。COE中、低剂量组MVD明显高于顺铂组(P<0.01),而高剂量组与顺铂组比较,无统计学差异(P>0.05)。流式细胞术显示COE增加荷瘤小鼠脾内成熟DCs (CD11c+CD11b+)及CD8+T细胞的数目(P<0.05或P<0.01),并呈剂量依赖性。结论：一定浓度的COE有抑制肿瘤生长的作用,其机制可能与促进肿瘤细胞凋亡及抑制肿瘤血管生成有关。同时,COE增加成熟DCs及CD8+T细胞的数目,提高机体的CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫反应。