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卵巢癌是继宫颈癌和子宫内膜癌的三大恶性肿瘤之一,其病死率高居妇科恶性肿瘤之首,由于起病隐匿、早期缺乏特异性症状与体征及有效的医学筛查手段,约70%卵巢癌患者就诊时已发生局部或远处转移,失去了手术的最佳时期,结果导致5年的总体生存率欠佳。早期卵巢癌(Ⅰ期和Ⅱ期)的远期生存率可达到80%~95%,相比之下,晚期卵巢癌(Ⅲ期和Ⅳ期)的远期生存率只有10%~30%。因此卵巢恶性肿瘤存在“两个70%”:超过70%的患者确诊时已属晚期;约70%的患者在两年内复发。故由此可见,寻找早期诊断及有效的治疗方法对于卵巢癌患者的生存率至关重要。近几年,学者们一直在寻找具有特异性的方法,以提高卵巢癌的生存率,保证患者的有效预后。另外一种学说“二元论模型”认为,卵巢癌分为高级别和低级别两类。高级别卵巢上皮性癌占卵巢癌发病的75%,占卵巢癌病死率的90%,其发病迅速,侵袭性极强,常伴发广泛的盆腹腔转移和种植,预后极差。而低级别卵巢上皮性癌发病缓慢,多经历良性、交界性和低度恶性的发展过程,多为早期,预后较好。因此高级别卵巢上皮性癌由于极易发生侵袭和转移,是威胁妇女健康的恶性肿瘤。然而其发生侵袭和转移的机制不明。近来,继mi RNA的大量研究之后,被称为长链非编码RNA(long non-coding RNA,lnc RNA)的一类分子量大于200nt的非编码RNA被发现并逐渐受到越来越多的研究。因其对靶基因表达的调控作用,lnc RNA参与了许多癌症发生、发展的过程。近年来的研究表明lnc RNA参与了转录激活、染色质修饰、转录干扰和核内运输多种重要的调控。图1 Lnc RNA的调控我们的前期研究,对44例卵巢癌组织及14例正常卵巢组织样本采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)的方法检测长链非编码RNA HOTAIR m RNA的表达。结果卵巢癌组织中HOTAIR m RNA表达高于正常卵巢组织[(1.26士0.27 vs.(0.14士0.09)],差异有统计学意义(P﹤0.05),病理类型为低度分化及未分化的卵巢癌组织中HOTAIR m RNA表达高于中-低、中一高及高度分化组织﹝(1.65士0.4 1)vs(0.39士0.l4)﹞,差异有统计学意义(P﹤0.05)。结论卵巢癌组织中HOTA IR的表达增高,且癌组织分化越低,HOTA IR表达越高。提示HOTA IR有可能作为发现卵巢癌,并判断其恶性程度的一个分子标志,可能在卵巢癌的发生、发展中扮演重要的角色。但机制不清。因此本研究拟在前期基础上进一步研究Hotair在卵巢癌中的作用及其机制。为Hotair在卵巢癌中的作用以及精准治疗提供理论依据和基础。第一部分HOTAIR促进卵巢上皮性癌恶性生物学行为及其机制的研究目的研究沉默HOTAIR后对上皮性卵巢癌恶性生物学行为的影响。方法(1)q PCR检测在HOTAIR在卵巢癌细胞株SKOV3,OVCAR3和A2780的表达情况。(2)沉默HOTAIR后,划痕实验检测卵巢癌细胞转移能力,transwell检测卵巢癌细胞侵袭能力,Ed U检测卵巢癌细胞增殖能力。结果(1)HOTAIR在SKOV3和OVCAR3细胞中表达高于A2780细胞;(2)沉默HOTAIR后,卵巢癌SKOV3细胞转移、侵袭和增殖能力降低;结论沉默HOTAIR可以抑制卵巢癌SKOV3细胞恶性生物学行为。第二部分HOTAIR通过mi R-214和mi R-217调控PIK3R3参与卵巢癌恶性生物学行为目的探索HOTAIR影响卵巢癌恶性生物学行为的分子机制。方法(1)生物信息学预测HOTAIR可能调控的ce RNA;(2)q PCR检测沉默HOTAIR后,PIK3R3的表达情况;同时检测沉默PIK3R3后HOTAIR的表达情况;(3)q PCR检测沉默HOTAIR或PIK3R3后,mi R-214和mi R-217表达情况;(4)q PCR检测mi R-214和mi R-217以及mi R-214和mi R-217inhibitor对HOTAIR和PIK3R3的影响;(5)双荧光素酶报告基因检测HOTAIR或PIK3R3是否是mi R-214和mi R-217的直接靶点。(6)免疫组化检测PIK3R3在卵巢癌组织的表达情况;(7)沉默PIK3R3后,检测卵巢癌细胞的增殖、转移和侵袭能力。结果:(1)生物信息学预测HOTAIR和PIK3R3互为ce RNA,HOTAIR和PIK3R3是mi R-214和mi R-217的潜在靶点;(2)沉默HOTAIR后,PIK3R3表达降低;沉默PIK3R3后,HOTAIR表达下调(P<0.05);(3)沉默HOTAIR或PIK3R3后,mi R-214和mi R-217表达上调(P<0.05);(4)转染mi R-214和mi R-217 mimics后,HOTAIR或PIK3R3表达降低;转染mi R-214和mi R-217 inhibitor后,HOTAIR或PIK3R3表达增加;(5)和对照组比较,共转染mi R-214 mimics和p MIR-HOTAIR3’UTR后,荧光素酶活性明显下降(P<0.05);和对照组比较,共转染mi R-214 mimics和MIR-HOTAIR 3’UTRm后,荧光素酶活性无明显改变(P>0.05);共转染mi R-217 mimics和p MIR-HOTAIR3’UTR后,荧光素酶活性明显下降(P<0.05);和对照组比较,共转染mi R-217 mimics和MIR-HOTAIR 3’UTRm后,荧光素酶活性无明显改变(P>0.05);(6)免疫组化结果显示,PIK3R3在卵巢浆液性癌和粘液性癌中表达高于正常卵巢组织;(7)沉默PIK3R3后,SKOV3细胞增殖能力、转移能力和侵袭能力均受到抑制。结论:卵巢癌SKOV3细胞株沉默HOTAIR基因表达后,细胞增殖、转移和侵袭能力降低;HOTAIR通过mi R-214和mi R-217靶向PIK3R3调控卵巢癌SKOV3细胞的恶性生物学行为。第三部分沉默HOTAIR影响SKOV3体内成瘤能力目的探究HOTAIR在体内对卵巢癌SKOV3细胞生长的影响方法(1)慢病毒载体构建HOTAIR沉默的稳定细胞株,然后移植到裸鼠左侧腋窝,观察移植瘤生长情况;(2)采用免疫组织化学检测沉默HOTAIR基因后,裸鼠移植瘤中PIK3R3的表达情况。结果(1)和对照组比较,沉默HOTAIR后,移植瘤生长缓慢,体积和重量降低(P<0.05)(2)免疫组化结果显示,卵巢癌SKOV3细胞株感染慢病毒携带的HOTAIR基因sh RNA后,沉默组和对照组比较,PIK3R3的表达降低(P<0.05)。结论沉默HOTAIR后,卵巢癌致瘤能力降低。