脑缺血是导致人类死亡和残疾的最常见原因之一,目前已知脑梗塞后50%以上的梗塞血管可以自发再通,而再通后的再灌注损伤机制一直是研究的热点。当体内外各种因素改变导致的脑部局部脑组织血液供应障碍,当血流恢复再通时,人体内的细胞遭到各种刺激后产生一系列反应,产生相应的各种损害,称为脑缺血再灌注(Cerebral ischemia reperfusion,CIR)损伤。CIR损伤是脑内缺血缺氧后一系列病理生理反应的结果,如脑内自由基、兴奋性氨基酸、Ca2+、炎性细胞因子等的增多而造成损害作用。在脑缺血的中心部位,脑组织缺血缺氧,导致细胞短时间内细胞离子平衡被打破,代谢功能受损,使细胞肿胀,发生坏死。围绕在缺血中心区域外有一条缺血半暗带,于缺血再灌注后慢慢形成,需要数日时间,属于迟发性神经元的死亡(delayed neuronal death,DND),其主要表现为细胞凋亡,该区发展为不可逆损伤的速度相对较慢,若没有进行干预或治理,任其发展,缺血半暗带的细胞也将成为永久死亡的一部分。因此,研究引起CIR后参与细胞凋亡的相关信号转导通路,通过对相关信号转导进行调控,干预细胞凋亡,挽救缺血半暗带的濒临死亡的神经元,可能为CIR损伤的治疗提供新的前景。研究表明有着细胞质和细胞核联系枢纽之称的丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)级联途径参与脑缺血再灌注损伤的过程,在细胞凋亡的信号转导方面起着关键性的作用。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase,JNK),是一种能够使c-Jun(一种转录调节因子,属亮氨酸拉链家族成员)氨基末端活性区丝氨酸63和73位发生磷酸化的蛋白激酶,属于应激活化蛋白激酶,MAPK家族中的重要家族成员之一,包含JNK1、JNK2、JNK3三个主要成员。JNK家族是中枢神经系统中关键的信号转导通路之一,可被多种因素激活,参加多个体内系统的促凋亡作用。如受外界因素刺激,模体中的丝氨酸、苏氨酸被JNKK1、JNKK2磷酸化后而激活,活化c-Jun和ATF-2等多种蛋白质,激活转录因子AP-1(Jun-Jun、Jun-Fos或Jun-ATF结合体),AP-1启动FasL,使FasL表达增强,从而影响细胞凋亡的发生,或通过Bcl-2和Bcl-xL的磷酸化,激活线粒体通路,促进细胞色素C释放,激活Caspase-3主导的级联反应,从而影响细胞凋亡的发生。SP600125为2001年发现的一种JNK的竞争性ATP特异性抑制剂,能阻断所有亚型JNK的催化区域可逆性的抑制JNK活性,显著抑制磷酸化JNK的表达,拮抗多种凋亡、炎症因子的表达。许多实验证实SP600125阻断剂可以有效抑制脑缺血再灌注后JNK的表达,减少细胞凋亡,对神经元损伤具有保护作用。众多实验表明,针刺疗法对缺血性脑卒中具有独特的疗效,而针刺对缺血性脑卒中后c-jun氨基末端激酶信号通路的机制尚未进行深入研究。为此,本课题拟用电针疗法作用于缺血再灌注后大鼠,观察缺血再灌注后大鼠脑缺血灶内细胞凋亡和JNK信号转导通路的变化情况,探讨电针疗法对脑缺血再灌注损伤保护作用的可能机制,为临床上电针治疗缺血性脑血管疾病提供科学的理论依据。目的:观察大鼠脑缺血再灌注后的神经功能缺损情况,局灶性脑缺血的病理形态、不同时间段的神经细胞凋亡、磷酸化JNK的表达以及电针和JNK抑制剂对它们的影响,进一步了解缺血再灌注后脑内JNK信号通路的调控变化以及电针疗法对它的干预作用,以期为临床上电针治疗缺血性脑血管疾病提供科学的理论依据。方法:将250只雄性Sprague-Dawley大鼠采用随机数字法分为假手术(Sham)组、模型(I/R)组、电针(EA)组、JNK抑制剂(SP)组,JNK抑制剂+电针组(SP+EA)每组50只,每组又分为5个时间亚组,即2h、6h、1d、3d、7d,5个时间段组,每亚组各10只,共25小组。局灶性脑缺血再灌注模型制备参照Zea Longa的方法,抑制剂组在模型制备前半小时在侧脑室缓慢匀速注入JNK抑制剂。电针组:大鼠造模成功清醒后在规定时间时行电针治疗,取“尺泽”与“合谷”,“足三里”与“三阴交”,用0.3 mm ×25 mm 一次性毫针针刺,电针由“尺泽”与“合谷”,“足三里”与“三阴交”2组穴位组成,采用疏密波,频率2/15Hz,强度2mA,以穴位周围组织轻微抖动为度,每次时间20min,2h、6h、1d亚组只进行一次处理,3d组每日行电针处理,共3次,1w组每日行电针处理,共7次。在每天电针的同一时间抓取模型组和抑制剂组的大鼠,进行固定,但不进行电针干预。观察指标如下:(1)评定缺血再灌注后各组大鼠不同时间段神经功能缺损情况。(2)观察缺血再灌注后大鼠缺血灶部位的病理形态学改变。(3)观察各组大鼠缺血灶部位不同时间段细胞凋亡情况。(4)观察各组大鼠缺血灶部位不同时间段磷酸化c-jun氨基末端激酶表达变化。数据处理:所有的数据统计均在SPSS20.0上进行。数据均采用均数±标准差(x±s)的形式表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。结果:(1)脑缺血再灌注后的大鼠出现不同时程出现不同程度的神经功能缺损症状,脑缺血再灌注后2h、6h大鼠神经功能缺损严重,随着时间延长,各组大鼠神经功能缺损症状有所恢复,脑缺血再灌注后3d、7d时各组大鼠神经功能缺损症状恢复明显。缺血再灌注后1d,电针组和JNK抑制剂组与模型组比较,差异较显著(P<0.05),JNK抑制剂+电针组与模型组比较,差异显著(P<0.01);缺血再灌注后3d和7d,电针组、JNK抑制剂组和JNK抑制剂+电针组的大鼠神经功能缺损评分与模型组比较,差异显著(P<0.01)。(2)形态学比较:正常组的大鼠脑组织结构清晰完整,细胞排列整齐有序,细胞核圆而大,胞浆丰富;脑缺血再灌注后面大鼠脑结构境界模糊,可见神经细胞坏死、缺失表现,细胞见筛网状结构,排列紊乱,细胞核固缩深染,可见部分核仁消失,胞质浓缩,胞浆变性。脑梗死体积比较:缺血再灌注后6h,电针组脑梗死体积较模型组比较,差异较显著(P＜0.05),缺血再灌注后1d,电针组、JNK抑制剂组的脑梗体积较模型组比较,差异较显著(P<0.05),缺血再灌注后3d、7d,电针组、JNK抑制剂组和JNK抑制剂+电针组脑梗体积较模型组比较,差异较显著(P<0.01)。(3)细胞凋亡比较:脑缺血再灌注后的大鼠脑缺血灶处可见细胞收缩,体积变小,染色质浓缩,细胞间隙变小。在缺血再灌注后不同时间段方面,缺血再灌注后2h,可见凋亡细胞数量增多,在缺血再灌注后1d时,凋亡细胞阳性反应物增高并达到最高峰,随后凋亡细胞数量开始下降,缺血再灌注后7d,凋亡细胞数量降至最低,与同时间段正常组比较,有显著差异(P<0.01)。在不同处理方面,脑缺血再灌注后2h、6h,电针组、JNK抑制剂组和JNK抑制剂+电针组的阳性反应物与模型组比较,减少较显著(P<0.05),脑缺血再灌注后1d、3d,电针组、JNK抑制剂组和JNK抑制剂+电针组的阳性反应物与模型组比较,减少显著(P<0.01);脑缺血再灌注后7d,各组神经细胞凋亡率均呈下降趋势,电针组、JNK抑制剂组与同时段的模型组比较,减少较显著(P<0.05),JNK抑制剂+电针组的阳性反应物与模型组比较,减少显著(P<0.01)。(4)p-JNK表达水平的比较:大鼠缺血再灌注后2h,p-JNK表达水平开始升高,6h表达增强,再灌注1d时达到最高值,随后逐渐下降,3d、7d时p-JNK表达水平降低,与同时间段假手术组比较,差异显著(P<0.01)。缺血再灌注后2h和3d时,电针组、JNK抑制剂组和JNK抑制剂+电针组的p-JNK表达较模型组降低,差异较显著(P<0.05);再灌注后6h、1d时,电针组、JNK抑制剂组和JNK抑制剂+电针组的p-JNK表达较模型组降低,差异显著(P<0.01);缺血再灌注后7d时,JNK抑制剂+电针组与模型组比较,差异较显著(P<0.05)。结论:1.电针“尺泽”与“合谷”,“足三里”与“三阴交”可以降低脑缺血再灌注大鼠的神经功能缺损评分,改善脑组织形态,降低细胞凋亡指数。2.电针“尺泽”与“合谷”,“足三里”与“三阴交”可以下调脑缺血再灌注后的p-JNK的表达。3.脑缺血再灌注后细胞凋亡和p-JNK表达在1d时达到高峰,电针干预可明显下调在1d时细胞凋亡及p-JNK的表达。4.实验结果提示“针刺刺激—启动JNK信号调控-拮抗细胞凋亡”,是电针修复脑缺血再灌注损伤的可能作用机制之一。