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乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,也是女性与癌症相关死亡的首要原因。肿瘤的发生与原癌基因激活、抑癌基因沉默、DNA损伤修复缺陷等机制密切相关。某些抑癌基因在肿瘤发展过程中以各种不同的方式失活:如染色体的缺失,染色体插入或重排、单个碱基的突变或表观遗传改变如DNA甲基化。乳腺癌发生过程中相关基因异常的DNA甲基化破坏了基因的稳定性,使其发生可遗传的转录沉默。DNA甲基化在基因转录调控及细胞恶性转化过程中的重要作用已被人们所认可。此外,异常的DNA甲基化在肿瘤发生过程中往往是一个早期事件,甚至比一些可见的病变更早发生。大多数的生命活动都需要通过相应的酶来催化调控,DNA甲基化的状态的改变也不例外,因此对调节DNA甲基化状态的酶进行深入研究,对更好地了解DNA甲基化有重要意义。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNMTs)催化和维持的,主要包括DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT1的主要作用是通过将甲基化信息传递给子代细胞,保持DNA甲基化模式的延续;而DNMT3a和DNMT3b主要参与调节DNA从头甲基化。 ATM( ataxia telangiectasia mutated gene)是共济失调毛细血管扩张症(ataxia telangiectasi,AT)的突变基因,作为DNA损伤反应系统的核心组成部份,常被认为是一种肿瘤抑制基因,同时也被证实与乳腺癌的易感性有一定相关性。有研究发现,ATM基因启动子区域的甲基化与包括乳腺癌在内的许多癌症相关。由于甲基化是可逆的过程,可以通过去甲基化作用从而恢复基因的表达和功能。大量研究证据表明环境致癌物的长期暴露与乳腺癌发生有着密切联系,而致癌物诱导细胞DNA损伤是其致癌作用的重要病理基础,因此研究ATM这一与DNA损伤修复紧密相关的基因在化学致癌物诱导乳腺细胞癌变过程的变化,对于揭示乳腺癌发生的机制以及探索乳腺癌的预防控制措施具有重要意义。 越来越多的研究表明,膳食中的一些天然化合物可以通过抑制DNA甲基转移酶的活性而改变癌细胞中DNA甲基化状态,从而使甲基化沉默的抑癌基因恢复表达。二氢杨梅素(Ampelopsin,AMP)是从藤茶等植物的茎叶中提取的一种二氢黄酮醇类化合物,是一种天然膳食成分,已被报道具有广泛的生物和药理活性,如抗炎、抗氧化、保肝、抗肿瘤等。但其抗癌作用的确切分子机制尚未明确,尤其是在肿瘤发生阶段的作用研究较少。 基于以上分析,本研究采用人正常乳腺上皮细胞MCF-10A长期暴露于低剂量的烟草及环境致癌物NNK和B[a]P建立体外乳腺癌变细胞模型,研究AMP对乳腺肿瘤发生阶段的影响,并观察ATM基因甲基化在乳腺癌变过程的变化及AMP的干预效应,以探讨AMP影响乳腺癌发生的潜在表观遗传机制。 主要实验结果和结论如下: 1.不同浓度(5_、10^M、20^M和40^M)AMP处理人乳腺癌MCF-7细胞48h后,采用CCK-8法检测细胞活力,结果显示5^M AMP处理对MCF-7细胞活力无显著影响,但10^M、20^M和40^M AMP处理的细胞活力随处理浓度的增高而显著下降(P<0.05),AMP的IC5Q约为20pM。 2.100pmol/L NNK和100pmol/L B[a]P的化学致癌物联合反复处理正常乳腺上皮细胞MCF-10A,随着处理周期数的增加,细胞逐步具有一些肿瘤细胞的生物学特性,具体表现为:生长因子的依赖性逐渐降低,锚定非依赖性生长能力和细胞划痕愈合能力逐渐增强,DNA损伤程度加强(yH2AX焦点数量增加),而20pM AMP与致癌物联合作用时,能够抑制细胞发生上述细胞生物学特性的改变。 3.在化学致癌物诱导的MCF-10A乳腺细胞癌变模型中,致癌物组处理10、15个周期(P10、P15)时,基因组整体DNA甲基化水平明显降低(P〈0.05);而AMP与致癌物联合处理组在整个致癌模型各时相点对基因组整体DNA甲基化水平无显著性的影响。 4.致癌物处理组MCF-10A细胞的DNMT1酶活性及表达水平随处理周期数的增加而显著上升,20^M AMP与致癌物联合处理组MCF-10A细胞的DNMT1酶活性及表达水平则从P10起显著下降。 5.计算机模拟分子对接结果显示,AMP可能通过与DNMT1结构活性域特异性位点相结合,从而抑制其活性。 6.致癌物处理组MCF-10A细胞中ATM基因的表达水平明显降低,而20^M AMP与致癌物联合处理组ATM基因的表达水平则明显升高,且相应的变化具有时间依赖效应。然而,与ATM相关的CHK2、RAD51和p53基因的表达水平在致癌物处理组细胞中无明显改变,在AMP和致癌物联合处理组则随处理代数增加而表达增强。 7.MSP检测结果显示,在致癌物处理的MCF-10A细胞中,随处理周期数增加,ATM基因甲基化条带(M条带)亮度逐渐变强,非甲基化条带(U条带)亮度逐渐减弱,提示致癌物使ATM基因启动子发生了一定程度的甲基化作用。经AMP与致癌物联合作用的MCF-10A细胞中,自P10开始,U条带亮度明显增强,M条带亮度则相应减弱,表明AMP可显著诱导ATM基因启动子区域发生去甲基化。 上述研究结果表明AM P能够抑制致癌物诱导的人正常乳腺MCF-10A细胞癌变发生,这一作用可能与其抑制DNMT1活性和表达水平,降低致癌物诱导的抑癌基因ATM启动子的甲基化增强,进而上调ATM表达有关。