RNA干扰(RNAi)是一种在真核生物中广泛存在的基因表达调控机制,在昆虫细胞抗病毒感染过程中也发挥着重要的作用。在病毒感染细胞时,一些昆虫病毒也能编码RNAi抑制蛋白从而抑制宿主细胞的RANi抗病毒效果,促进病毒感染。家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)是呼肠孤病毒科(Reoviridae)质型多角体病毒属(Cypovirus)的典型种。探明BmCPV感染对宿主细胞RNAi的影响、BmCPV抑制宿主细胞RNAi系统的机制、BmCPV S8片段的功能对理解病毒与宿主的相互作用有重要帮助,也有可能为病毒防治提供分子靶标。目前已发现BmCPV基因组能成为家蚕中肠组织细胞中的RNAi通路的靶,有关BmCPV在感染过程中能否能通过编码某种蛋白抑制RNAi系统从而促进病毒感染的研究还未涉及。有关S8片段的功能研究,总体还停留在通过序列比对进行推测阶段,还没有功能方面的研究。为了验证家蚕细胞利用外源RNA干扰(exo-RNAi)抗病毒通路抑制病毒的入侵与增殖,在本研究中,我们通过高通量测序检测了感染BmCPV的Bm N细胞中病毒来源的small RNA(vs RNA)。结果显示,在感染BmCPV的Bm N细胞中存大量BmCPV来源的vs RNA,其大小分布主要集中在19nt,推测是病毒基因组ds RNA被宿主细胞的Dicer-2切割形成;统计分析结果显示,起源于病毒基因组S3和S4ds RNA片段上的vs RNA较多;所有vs RNA均与病毒基因组ds RNA的正链匹配;与病毒基因组比对结果显示,病毒基因组S3、S4和S10 ds RNA片段上存在vs RNA的高匹配区(hot spots),表明vs RNA的生成存在片段以及片段区域偏好性;切割位点的保守性分析结果显示,在vs RNA的5’和3’端的切割位点附近存在碱基偏好性。已有的研究表明,病毒感染宿主昆虫时,宿主细胞利用自身exo-RNAi通路抵抗病毒入侵和增殖,同时,病毒基因组也会编码RNAi抑制蛋白,与宿主细胞的RNAi系统对抗。为了探讨BmCPV是否能抑制Bm N细胞中的RNAi通路以及在病毒基因组编码的10个蛋白中是否也存在RNAi抑制蛋白,我们将萤火虫荧光素酶基因的特异性小干扰RNA或双链RNA(si RNA或ds RNA)与双荧光素酶报告基因表达载体共转染到BmCPV感染的Bm N细胞中,通过检测分析双荧光素酶相对活性研究BmCPV感染对Bm N细胞中RNAi的效果影响;我们还将萤火虫荧光素酶基因特异性siRNA与双荧光素酶报告基因表达载体共转染到表达单个BmCPV病毒蛋白的转基因细胞中,检测BmCPV病毒蛋白对Bm N细胞中RNAi的影响。结果显示,BmCPV感染能抑制Bm N细胞中siRNA诱导的RNAi,对dsRNA诱导的RNAi没有显著影响;BmCPV表达的病毒蛋白VP8能抑制siRNA诱导的RNAi。业已明确BmCPV表达的病毒蛋白VP8能抑制BmN细胞中si RNA诱导的RNAi,但作用机制还未明确。BmCPV基因组由十个ds RNA片段(S1~S10)组成,VP8为S8片段编码的病毒非结构蛋白。对S8片段的功能研究结果显示,过表达VP8蛋白可促进BmCPV的增殖,VP8在Bm N细胞和酵母细胞中均定位在细胞质。荧光定量PCR结果显示,VP8抑制细胞中Dcr2、Apa和Cyt基因表达。细胞流式实验检测结果显示,过表达VP8基因会促进BmN细胞增殖。Co-IP筛选及质谱鉴定VP8的互作蛋白,结果显示VP8与线粒体抑制素复合物蛋白2、核酸内切酶-逆转录酶、VIG蛋白和TCTP等蛋白以及与转录翻译有关的因子、酶互作。酵母细胞生长实验显示,BmCPV VP6-VP10(多角体蛋白)对酵母细胞生长均有不同程度的抑制效果,其中VP8蛋白对酵母细胞毒性最大。共定位实验表明VP8蛋白在酵母中与Dcp2蛋白共定位、在家蚕细胞中可与Ago2共定位。