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胃肠安丸是一种传统的中成药,具有消除湿热病原,缓解疼痛,调节消化不良的作用。该药物已广泛用于临床,用于许多胃肠疾病的治疗,如腹泻、腹痛和细菌性痢疾。到目前为止,已进行了许多研究,包括胃肠安的质量稳定性、药代动力学,研究其止泻、抗酒精诱导的胃肠损伤、对胃肠动力的调节作用以及胃肠安丸甲醇提取物对5-Fu诱导的肠损伤的保护作用。中药厚朴是胃肠安丸中的一味主药,根据前期的工作基础,胃肠安丸的甲醇提取物口服给药后,其中来自厚朴的木质素类成分厚朴酚及和厚朴酚吸收迅速。在胃肠道中,厚朴表现出抗胃溃疡、抗腹泻、抗食管阻塞和肝脏保护作用。厚朴的甲醇提取物由厚朴酚(1%),和厚朴酚(0.17%)和4-O-甲基和厚朴酚(0.0003%)组成,厚朴酚与和厚朴酚是厚朴甲醇提取物中的主要活性物质,有资料显示这两种活性物质具有调节肠道疾病的功能,并且都具有较好的抗炎抗氧化的活性,展现出保护肠道屏障的功能,这些性质是厚朴酚在肠道中发挥治疗作用的基础。癌症化疗药治疗的基础是消融快速增殖的恶性细胞。然而,大多数化疗药也杀死正常增殖细胞,例如在胃肠道的粘膜细胞。化疗药所导致胃肠功能障碍,其中一个重要机制是导致肠道粘膜屏障的损伤,即黏膜炎。肠道粘膜屏障包括四个部分:机械屏障、化学屏障、生物屏障及免疫屏障。化疗药在治疗结肠癌时,会伴随着严重的胃肠道毒副作用,不仅影响患者生存质量,更会限制化疗药的治疗效果。但是,防治化学治疗引起的粘膜炎的有效策略尚未确定。因此,有必要制定有效的策略来预防化疗引起的肠道毒性,从而改善治疗效果和生活质量。本研究的目的是证明WCA对伊立替康(CPT-11)诱导的小鼠肠损伤的保护作用。为了说明WCA对粘膜炎的潜在机制,WCA中主要草药厚朴(HP)及其主要活性成分厚朴酚的作用进行了深入的研究。1胃肠安丸全方对伊立替康引起肠毒性的治疗作用伊立替康盐酸盐,即CPT-11,是结肠癌患者常用的抗癌药物。但肠毒性限制了其药效。是结肠癌患者的有效且常用的药物。CPT-11和SN-38通过抑制拓扑异构酶I(Top I)发挥其细胞毒性,然后引发S期特异性细胞死亡以抵抗肿瘤疾病。然而,化疗药物在癌症治疗期间杀死坏和健康的细胞,导致副作用。因此,本研究用WCA评估其在CPT-11处理的CT26荷瘤小鼠中对肠道保护作用的效果。在本实验中,测定了胃肠安全方联合伊立替康的作用,联合作用通抗肿瘤效果及肠道粘膜损伤程度进行评价。首先建立了CT26结肠癌皮下植瘤小鼠动物模型,将CT 26系的瘤株植入小鼠腋下,以便测定肿瘤的生长情况,待肿瘤生长为1cm×1cm大小后,将其随机进行分组,分别为肿瘤模型组,伊立替康治疗组,胃肠安丸+伊立替康组,阳性药洛哌丁胺+伊立替康组,分组后给药治疗十一天,胃肠安及阳性药咯哌丁胺在注射伊立替康前半小时给药。在治疗过程中每天测定动物的体重情况,监测肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线。在实验的最后一天取材,称量肿瘤重量;通过HE染色技术,观察伊立替康对小鼠的十二指肠、空肠、回肠、结肠的粘膜损伤,并对比各组间动物不同肠断肠粘膜在显微镜下的差异,验证胃肠安丸全方对伊立替康动物模型的肠粘膜损伤的影响;通过酶联免疫试剂盒检测体内氧化应激水平,并且检测肠道促炎因子NF-κB及IL-6水平。结果显示,WCA的干预调节了小鼠的体重减轻,改善组织病理学参数,小肠部位各肠段(十二指肠,空肠,回肠)的HE染色可以观察到空白组小肠绒毛较长、排列紧密、刷状缘清晰,而在给予化疗药后,长度变短、密度减少、绒毛脓肿变形,腺体结构遭到破坏、边缘不清晰,并且伴有严重的炎症细胞浸润,而在与胃肠安丸联合之后,小肠的绒毛排列更为齐整,边缘变清晰绒毛密度与伊立替康组显著性增加,腺体结构完整。在结肠部位,空白组隐窝排列整齐、结构完整为特点,而在伊立替康单给药组中,病理变化明显,隐窝部位空泡化严重,扭曲变形,而胃肠安丸联合治疗之后,结肠结构得到明显的改善,证明胃肠安丸对肠道粘膜具有一定的保护作用。在通过对机体过氧化水平(MDA)及氧化自由基清除能力(SOD)测定,评定机体的氧化应激水平,由数据表明,在给予化疗药治疗之后,机体的过氧化水平显著升高,且抗氧化力(SOD)显著降低,表明在化疗药治疗过程中,脂质过氧化的水平增加,机体的氧化自由基清除力降低,造成氧化/抗氧化失衡,激活氧化应激途径,使得细胞受到损伤程度大,而与胃肠安联合之后,能够显著改善这种状态,其显著增强了机体的氧化自由基清除力,从而保证了氧化/过氧化的平衡,降低氧化应激水平。氧化应激可直接引起组织损伤并触发一系列炎症反应,而在炎症反应中NF-κB在此阶段起着至关重要的作用。一旦此阶段被化疗药及ROS激活,NF-κB引起基因表达及促炎症因子如TNF-α及IL-6的产生,这些促炎症因子反过来又会导致组织损伤及凋亡。NF-κB也引起粘附分子及C0X-2基因的表达,而导致血管生成。一系列促炎介质通过正反馈途径放大整个炎症过程,进而加剧组织损伤。这个过程主要发生在粘膜下层与上皮基底,胃肠粘膜溃疡及其萎缩性变化为特征,这是因为在这一过程中组织损伤与干细胞死亡的高潮阶段。粘膜上皮的完整性及功能被破坏。粘膜溃疡部位的细菌通过刺激充血及激活巨噬细胞进一步导致炎症。通过抑制氧化应激,调节炎症反应来降低肠粘膜炎的严重程度,显示出胃肠安丸在减轻CPT-11诱导的胃肠道毒性方面的作用,但不会改变化疗药CPT-11的抗肿瘤效果。2胃肠安丸主要药味厚朴对伊立替康引起肠毒性的治疗作用厚朴是胃肠安丸中的主要药味,已被广泛用于胃肠疾病。为了研究胃肠安丸对CPT-11引起的腹泻的作用,选取其主要药味厚朴探索不同靶点抑制肠毒性的作用。本实验将厚朴药材粉末(200 g)用1L甲醇加热回流3次(每次1小时),然后在减压下蒸发以除去甲醇,并在低于45℃的温度下获得粗萃取物(62.6g),获得产率为31.3%(w/w)的厚朴甲醇提取物。而后用健康小鼠建立伊立替康诱导的肠毒性模型,用于测定厚朴甲醇提取物对毒性的缓解作用。粘膜炎是最重要的肠毒性之一,研究表明有五个阶段,包括起始阶段、上调和信息产生阶段、信号和扩增阶段、溃疡阶段和愈合阶段。微生物菌群、氧化应激、炎症、粘膜免疫系统和肠紧密连接变化是致病因素。黏膜炎模型建立过程如下:适应一周后,将动物分成5组(n=8/组):正常动物对照组,CPT-11对照组,CPT/HP治疗组(HP-H:高剂量HP 800mg/kg,HP-L:低剂量HP为400 mg/kg),CPT/Lop处理为阳性对照(8 mg/kg)。从第2天至第5天施用CPT-11(50 mg/kg),而厚朴甲醇提取物及阳性药于第1天至第7天给药;实验过程中监测动物体重的改变,验证厚朴甲醇提取物对伊立替康腹泻模型小鼠的一般情况影响。腹泻情况用如下方法测定:0,正常(大便正常或无);1,轻微腹泻(湿软粪便);2,中度腹泻(湿粪和未成形大便,中度肛周染色);3,严重腹泻(水样便,严重的肛周染色);用以对各组小鼠在伊立替康注射后进行腹泻评估。实验最后,取小鼠的血清以及小肠大肠组织,冻存以待后续的生化分析。将来自每只动物的十二指肠,空肠,回肠和结肠的小片段在4%多聚甲醛中固定24小时,然后用乙醇和二甲苯进行组织脱水,将每个样品包埋在石蜡中,在载玻片中以5μm切片,进行苏木精和伊红(HE)染色。HE染色用光学显微镜进行一般组织学评估;测量整个切片中的绒毛高度和隐窝深度,对病理变化进行评分。应用免疫组化技术,对回肠的炎症因子的表达,用COX-2和i NOS抗体分别进行染色标记,同样的,也对结肠occludin和ZO-1蛋白表达情况进行测定;通过Image-Pro Plus软件测定所拍摄的图中染色部分的整体光密度(Integrated option density,IOD),定量的分析各组小鼠回肠粘膜上皮细胞的表达情况。另外,为了分析厚朴甲醇提取物的治疗机制,运用Western blot技术,对肠道的TLR-4及p-65表达水平进行测定。CPT-11对肠上皮细胞的直接或间接作用引发细胞凋亡,肠道干细胞的损伤最为严重,导致肠道增殖修复能力的降低,病理表现为肠隐窝的结构的破坏及小肠绒毛的变短;此外,体内的生理环境也出现的显著变化,健康细胞的凋亡触发了核因子NF-k B的激活,这一因子在炎症及免疫环节有着中心调控作用,调控下游的促炎因子的表达,使得体内炎症反应的放大,进一步损伤细胞;这一过程中,伴随着氧化自由基的过量产生。微生物群的变化不仅影响肠道完整性,还通过Toll样受体调节炎症反应(TLRs)和特异性免疫细胞进一步加重肠道损伤。在健康的肠道中,微生物群与宿主之间的关系是互利的。在化学治疗剂的治疗之后,发生这种关系的严重破坏,导致共生耐受性丧失和伴随肠屏障通透性增加的异常免疫应答。TLR募集不同的衔接蛋白,然后激活几个下游基因以编码促炎细胞因子。用CPT-11治疗的动物表现出严重的腹泻和体重减轻。在CPT-11肠道中观察到明显的粘膜损伤,病理表现为绒毛缩短,加深扭曲的隐窝。厚朴的治疗减轻了体重减轻,有助于恢复小肠和结肠的组织损伤。脂质对ROS敏感,导致膜过氧化,MDA是测量过氧化水平的生物标志物;SOD在体内系统中起着至关重要的作用,以防止ROS损伤。结果显示,CPT-11给药引起SOD活性显着降低,MDA水平明显增加,造成氧化/抗氧化失衡,激活氧化应激途径;厚朴处理后这两个因子水平趋于正常。这些结果表明厚朴可抑制化学治疗引起的氧化应激损伤。Toll样受体4(TLR-4)是感知DAMP的主要宿主受体,DAMPs可与细胞外定位的TLR-4部分相互作用并激活NF-κB信号通路。随着对TLR-4表达水平的分析,在CPT-11组中显着升高,而厚朴的参与则显着抑制了它的表达。实验中检测了炎症反应和肠屏障蛋白表达水平,NF-κB是粘膜炎发展的关键驱动因素,其引发促炎细胞因子TNF和IL-6的表达,i NOS在粘膜炎的发病机制中起重要作用,引起NO过量产生直接损伤组织。结果表明,厚朴给药后显着抑制了CPT-11诱导的炎性细胞因子的扩增,包括NF-κB,IL-6,TNF,COX-2和i NOS表达水平的增加。这些结果表明,厚朴对肠的保护作用可能通过调节抗氧化和抗炎能力以及保护肠屏障来介导。3胃肠安丸的主要活性成分厚朴酚对伊立替康引起肠毒性的治疗作用厚朴甲醇提取物中有多种成分,虽然证实了它具有缓解CPT-11的肠毒性作用,但是深入的作用机制需要进一步的研究。在本部分的实验中,同样建立了CPT-11的肠毒性模型,进行体内研究。SN-38葡萄糖醛酸苷(SN-38G)是CPT-11的无活性代谢产物,通过肠腔中的细菌β-葡糖醛酸糖苷酶代谢成活性形式7-乙基-10-羟基喜树碱(SN-38)。目前已经提出了一些不同的CPT-11胃肠道副作用机制,包括SN-38的积累和再激活,肠道微微生物的破坏和持续的粘膜损伤。首先,本实验运用大肠杆菌β-葡糖醛酸糖苷酶对厚朴酚及和厚朴酚的活性筛选,β-葡糖醛酸糖苷酶参与CPT-11的代谢而增强其肠毒性,厚朴的这两种活性单体对粪便中的β-葡糖醛酸糖苷酶均表现出一定的抑制能力,从而减少毒性物质在肠道内的积累,但结果显示,厚朴酚比和厚朴酚表现出更强的抑制作用;在此基础上,用厚朴酚进行了体内粘膜的保护作用研究。通过建立CPT-11诱导肠毒性模型,并用厚朴酚治疗干预,测量体重减轻情况和腹泻评分;通过苏木精和伊红(HE)染色表征肠损伤;检测CPT-11诱导毒性的中发生的免疫反应、炎症反应、肠屏障和大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶活性的变化。并且,本研究应用计算机模拟分子对接来揭示厚朴酚和β-葡萄糖醛酸酶之间的相互作用。结果表明,厚朴酚缓解体重减轻、腹泻和肠道损伤;通过增加SOD活性,降低TLR-4和NF-κB的表达水平,下调下游的促炎细胞因子来抑制氧化应激和炎症;CPT-11给药后,紧密连接蛋白occludin和ZO-1的表达显着降低,厚朴酚给药后促进了这些表达。总之,厚朴酚可通过抑制炎症途径和大肠杆菌β-葡萄糖醛酸酶活性来预防CPT-11诱导的肠毒性。4胃肠安丸的主要活性成分厚朴酚对其他化疗药引起肠毒性的治疗作用本部分测定了厚朴酚对另外两种化疗药奥沙利铂及5-氟尿嘧啶所导致的肠黏膜炎的作用,证实厚朴酚对化药引起的黏膜炎有治疗作用。研究证实了活性单体厚朴酚对其他化学治疗剂奥沙利铂和5-氟尿嘧啶(5-Fu)的保护作用。奥沙利铂是胃肠道癌症的一线治疗疗法,通常与其他化疗药联合使用。然而,很少有报道研究其胃肠道毒性。奥沙利铂处理的小鼠表现出体重减轻、腹泻和肠损伤,肠损伤特征在于绒毛的缩短和肠隐窝的破坏,以及结肠长度变化。厚朴酚显着缓解体重减轻,缓解腹泻,逆转组织病理学变化并防止结肠长度减少。奥沙利铂处理后体内氧化应激和炎症被激活,而厚朴酚通过增加SOD,GSH-Px和GSH的活性,降低NF-κB水平和下调促炎细胞因子来抑制这些反应。虽然奥沙利铂处理后回肠连接蛋白occludin和增殖性隐窝细胞的数量在回肠和结肠上减少,但厚朴酚给药促进了这些蛋白的表达。由奥沙利铂扰乱的粪便肠道微生物群组成被厚朴酚显着调节。因此,厚朴酚可以通过多途径阻止奥沙利铂诱导的粘膜炎的发展和进展。化合物5-Fu是治疗结肠癌的常用有效药物。但是,肠粘膜炎是临床应用的一般限制性原因。目前的结果证明厚朴酚可以通过减轻相关临床症状,抑制氧化应激和炎性细胞因子来预防5-Fu诱导的粘膜炎。总之,本研究表明WCA药丸可用于缓解CPT-11诱导的肠道毒性。而且,其成分厚朴酚在粘膜炎的治疗中起着至关重要的作用,对于扩大胃肠安丸的临床适应症提供理论基础。