由丝状真菌引起的植物病害是目前农业生产面临的主要问题,常规的化学防治方法存在着诸多诟病,例如农药残留、环境污染等问题,因此以环境友好型生防菌剂为代表的生物防治逐渐受到了人们的青睐,并得到了长足发展。目前,人们已经分离到了许多对植物病害具有良好防治效果的生防菌剂,并投入到了生产实践中。芽孢杆菌是细菌中研究最多的生防菌资源,研究发现其可以通过生态位竞争、直接拮抗、诱导植物产生系统防御和通过促进植物生长等途径达到防病治病的目的。生防芽孢杆菌通过直接产生蛋白酶、纤维素酶及几丁质酶等水解酶类水解病原真菌细胞壁来杀灭病原真菌是其重要的生防机制之一。TG116是本实验室从独角莲块茎中分离到的1株内生地衣芽孢杆菌。前期的研究表明,TG116对植物病原真菌具有广谱拮抗性,存在潜在的开发价值,但其抑菌机制尚不清楚。本研究以TG116为研究对象,采用层析和质谱联用等技术,分离、纯化和鉴定了TG116部分抗菌蛋白组分,并在生理生化、形态学和分子生物学水平探讨了其生防机制。主要研究结果如下:1.TG116对植物病原真菌具有广谱抗菌活性与极强的生长能力和环境适应性。2.TG116发酵液对植物病原真菌具有抗菌活性,最适发酵条件为温度30℃,pH 7.5,发酵时间120 h,增加氧含量可以提高发酵液的抑菌活性。3.70%饱和度（NH₄）₂SO₄是最佳的沉淀条件,得到的粗蛋白具有稳定的抑菌活性及蛋白酶与纤维素酶等生物学活性,且具有良好的温度稳定性与紫外照射稳定性。4.TG116产蛋白酶最佳单因素发酵条件为温度40℃,pH 8.0,时间48 h,溶氧量越大,蛋白酶活性越高,通过响应面法优化后,最佳发酵条件为温度40.8℃、pH 8.0、时间55 h,可使蛋白酶活性提高4倍;酶学性质表明该蛋白酶最适作用温度为50℃,最适作用pH为8.5,40℃水浴3 h后可保留80%以上的活性,具有良好的稳定性,50℃水浴2 h后保留60%以上的活性,高于60℃时失活;在pH大于7时,该蛋白酶具有较好的稳定性,活性基本保持不变,但在偏酸的环境下,迅速失活,所以为碱性蛋白酶;金属离子Mn²⁺、Co²⁺对蛋白酶酶活力具有一定的激活作用,其它金属离子如Mg²⁺、Ca²⁺、Na⁺、Zn²⁺、K⁺具有一定的抑制作用,变性剂具有强烈的抑制作用,且浓度越大抑制性越强,其中,EDTA的抑制性最强。5.TG116产纤维素酶最佳单因素发酵条件为温度40.0℃,pH 7.0,时间51 h,发酵体积为75 mL,通过响应面法优化后,最佳产纤维素酶发酵条件为温度39.0℃、pH 7.0、时间51.0 h,可使纤维素酶活性提高2倍;酶学性质表明该纤维素酶最适作用温度为50℃,最适作用pH为3.5,在40℃水浴3 h后可保留80%以上的活性,具有良好的稳定性,50℃水浴2 h后保留60%以上的活性,高于60℃时该纤维素酶失活;在pH小于6时,该纤维素酶具有较好的稳定性,活性基本保持不变,但在偏碱的环境下,基本丧失酶活力,说明该纤维素酶为酸性纤维素酶;金属离子Mg²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Ca²⁺、NH₄⁺、Li⁺对纤维素酶酶活力具有一定的激活作用,其它金属离子K⁺、Mn²⁺具有一定的抑制作用,变性剂具有强烈的抑制作用,且浓度越大抑制性越强,其中,Tris的抑制性最强。6.70%饱和度（NH₄）₂SO₄沉淀得到的粗蛋白经过DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析,得到了12个不同的组分,其中5个具有明显的抑菌活性;将其中1个组分进行Sephadex G-50分子筛层析与SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,得到了1条明显的条带,鉴定为胞外丝氨酸蛋白酶;该蛋白酶分子量约为86.17 kDa;显微观察发现该酶可导致病原真菌菌丝膨胀、折叠等异常现象,该蛋白酶还能影响孢子的萌发和发育,表现为使得孢子萌发率大幅度下降,已萌发孢子芽管细胞出现畸形或膨大,变成圆泡状物等。7.以已报道的丝氨酸蛋白酶编码基因为参照,通过设计专化引物克隆得到了1条长为1617 bp的片段,信息学证明其编码胞外丝氨酸蛋白酶,命名为Pase基因,并提交至GenBank（MK659579）;该蛋白酶相对分子量为53.84 kDa,理论等电点为5.29,分子式为C₂₃₂₁H₃₇₁₅N₆₂₃O₇₅₇S₁₂;蛋白N端含有明显的疏水性,有3个可能跨膜结构,构成该蛋白的二级结构有α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲等;具有3个保守序列,肽酶抑制剂I9（Peptidase inhibitor I9）、肽酶S8家族（Peptidase S8 family）和细胞表面丝氨酸蛋白酶（PA_C5a_like）;在细胞中可能存在于细胞质、线粒体基质、过氧化物酶体和溶酶体中,其N端含有1段信号肽,可能与该蛋白分泌到胞外的过程有关;最后对其蛋白质模体位置进行分析,发现可能具有N-糖基化位点、酪蛋白激酶II磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、丝氨酸蛋白酶,枯草杆菌酶家族,组氨酸活性位点与丝氨酸蛋白酶,枯草杆菌酶家族,丝氨酸活性位点,这些位点的存在与该蛋白发挥其功能可能有很大的关系。