研究背景与目的铅是对人体健康有害的重金属元素。主要损害神经、消化、造血、免疫系统和肾脏，可引起细胞一系列的功能变化。铅不仅具有神经毒性还具有免疫毒性，免疫系统是铅作用的重要靶器官之一。虽然人们对铅的免疫毒性作用已做了许多工作，但铅的免疫毒性机理尚未完全明了。铅吸收后进入血循环，约有95％的铅以不溶性磷酸铅稳定地沉积于骨骼系统，少量铅以磷酸氢铅、甘油磷酸化合物、蛋白复合物或铅离子(Pb²⁺)状态分布全身各软组织。有研究资料表明Pb²⁺可通过细胞膜离子通道进入细胞内，主要分布在细胞核和细胞浆以及线粒体、溶酶体、微粒体。众所周知，Ca²⁺在信号传导中起着极其重要的作用，Ca²⁺信号是淋巴细胞行使正常功能、识别抗原的关键性调节因素之一，细胞的多种功能受Ca²⁺信号调控，而多种胞外的信号也影响细胞内Ca²⁺信号，Ca²⁺信号失常会导致一系列病理过程。由于Pb²⁺和Ca²⁺的离子半径较近似，而且都为二价阳离子，因此探讨Pb²⁺对淋巴细胞内Ca²⁺浓度([Ca²⁺]i)的影响是我们理解Pb²⁺免疫毒性的基础。细胞内[Ca²⁺]i的瞬间变化可触发许多胞内信号事件，大多数依赖Ca²⁺的细胞过程都是通过Ca²⁺结合蛋白而实现的，在众多的钙结合蛋白中，钙调素（Calmodulin，CaM）是最重要的一种，CaM存在于所有的真核细胞中，对Ca²⁺特别敏感，CaM本身没有酶活性，Ca²⁺通过与CaM结合，调节细胞内30多种靶蛋白或靶酶的活性，改变多种靶蛋白的构象，是细胞内Ca²⁺信号传导途径中的主要信号转导分子。淋巴细胞信号传导事件的结果是一系列特异性反应基因转录活化，这些转录事件诱导淋巴细胞分化和增殖。实验证明信号传导事件导致淋巴细胞增殖获得分化能力是受级联调控的一系列基因活化事件的结果。IL-2基因的活化是这种级联一个极好的代表，在大多数免疫应答中起关键作用，因此我们认为铅染毒对淋巴细胞分泌IL-2的影响，是铅免疫毒性的一个很重要结果。基于以上观点，我们认为在分子水平上，选择Pb²⁺对淋巴细胞[Ca²⁺]i、CaM、细胞增殖及分泌功能的影响是研究铅免疫毒性的切入点，是理解铅免疫毒性的基础。第一部分铅染毒对淋巴细胞[Ca²⁺]i的影响研究目的探讨不同浓度Pb²⁺染毒对静息及活化淋巴细胞[Ca²⁺]i的影响。研究方法（1）研究对象：小鼠脾淋巴细胞悬液，共分4组，终浓度分别为10^-6MPbCl₂染毒组、10^-5M PbCl₂染毒组、10^-4M PbCl₂染毒组及对照组：（2）采用Fura2-AM标记淋巴细胞[Ca²⁺]i，用荧光分析仪检测淋巴细胞[Ca²⁺]i的变化。结果（1）不同浓度Pb²⁺染毒对淋巴细胞[Ca²⁺]i影响：未经染毒的淋巴细胞[Ca²⁺]i平均浓度在80.23-91.84 nM之间，当染毒时间在2min-20min时，随Pb²⁺染毒浓度增高及时间延长，淋巴细胞内[Ca²⁺]i有不同程度的升高，当染毒时间为10min时，淋巴细胞[Ca²⁺]i平均水平达到最高，其中10^-5MPbCl₂、10^-4MPbCl₂染毒组的淋巴细胞[Ca²⁺]i分别为：159.69±29.46nM及162.49±21.35nM，与对照组比较，差异有显著性（P＜0.05），此时两染毒组之间淋巴细胞[Ca²⁺]i的差异无显著性（P＞0.05）；染毒20min时，淋巴细胞[Ca²⁺]i平均水平与染毒10min相比略有下降，10^-5MPbCl₂、10^-4MPbCl₂染毒组淋巴细胞[Ca²⁺]i分别与对照组比较，差异有显著性（P＜0.05）；当染毒时间在1-24h的时间段时，各染毒组淋巴细胞[Ca²⁺]i逐渐下降，与对照组比较，差异无显著性（P＞0.05）。（2）CaM拮抗剂W-7作用后不同浓度Pb²⁺染毒对淋巴细胞[Ca²⁺]i的影响：未经染毒的淋巴细胞[Ca²⁺]i平均浓度在66.97-87.50 nM之间，随Pb²⁺染毒浓度增高，淋巴细胞[Ca²⁺]i浓度发生不同程度的变化，与未经W-7预处理的淋巴细胞[Ca²⁺]i比较，其增加的幅度有所减缓；染毒5min时，10^-5MPbCl₂、10^-4MPbCl₂染毒组的淋巴细胞内[Ca²⁺]i平均水平增高，与对照组比较，差异有显著性（P＜0.05）：染毒20min时，这种细胞内高[Ca²⁺]i情况依然存在。（3）无钙液悬浮淋巴细胞后不同浓度Pb²⁺染毒对淋巴细胞[Ca²⁺]i影响：未经染毒的淋巴细胞[Ca²⁺]i平均浓度在86.86-96.4 nM之间，当染毒时间为10-20min时，淋巴细胞[Ca²⁺]i平均水平明显增高，与对照组比较，差异有显著性（P＜0.05），但此时各染毒组之间淋巴细胞[Ca²⁺]i的差异无显著性（P＞0.05）。（4）Cl^-离子通道阻断剂、电压依赖性Ca²⁺通道（voltage-dependent calcium channel，VDCC）阻断剂对淋巴细胞[Ca²⁺]i的影响：在Pb²⁺染毒之前分别用5μmol／L Cl^-离子通道阻断剂呋塞米、VDCC阻断剂nifedipine 2.5μmol／L预处理细胞，再进行Pb²⁺染毒，结果荧光强度未见明显改变（P＞0.05）。（5）不同浓度Pb²⁺染毒对活化淋巴细胞[Ca²⁺]i的影响：各组淋巴细胞[Ca²⁺]i平均浓度明显增高，比静息时淋巴细胞[Ca²⁺]i增加约4-5倍。经One-Way-ANOVA分析，与对照组比较，各组之间差异无显著性（P＞0.05）。结论（1）Pb²⁺对淋巴细胞内[Ca²⁺]i的影响具有浓度、时间依赖性；（2）10^-4-10^-6M PbCl₂染毒对淋巴细胞[Ca²⁺]i的影响具有可逆性；（3）CaM参与了Pb²⁺对淋巴细胞[Ca²⁺]i影响的过程。（4）氯离子及VDCC通道阻断剂对Pb²染毒引起淋巴细胞[Ca²⁺]i的变化无影响。第二部分铅染毒对淋巴细胞内钙调素mRNA及钙调素蛋白表达的影响研究目的探讨不同浓度Pb²⁺染毒对淋巴细胞CaMmRNA转录水平及蛋白表达水平的影响，了解CaM转录水平与蛋白表达水平之间的相关性。研究方法（1）研究对象：小鼠脾淋巴细胞悬液，体外给予不同浓度Pb²染毒。（2）采用RT-PCR检测不同浓度Pb²⁺染毒后对淋巴细胞CaMmRNA表达水平的影响。（3）采用免疫组化及Western blot检测不同浓度Pb²⁺染毒后对淋巴细胞CaM的影响。结果（1）Pb²⁺染毒对淋巴细胞CaMmRNA的影响：染毒1h后，10^-5M、10^-6MPbCl₂染毒组的CaMmRNA的表达量有所增加，至染毒6h，10^-6MPbCl₂染毒组与对照组比较，CaMmRNA的表达量明显升高，差异有显著性（P＜0.05），而10^-5MPbCl₂染毒组在染毒1h后，CaMmRNA表达水平略有升高，染毒6h后，与对照组及10^-6MPbCl₂染毒组比较，CaMmRNA表达水平明显下降，差异有显著性（（P＜0.05））；10^-4MPbCl₂染毒组在染毒1h后，CaMmRNA表达量有所下降，当染毒至6h后，表达量与对照组及10^-6MPbCl₂染毒组比较明显减少，差异有显著性（P＜0.05）；而当染毒时间至12h、24h后，不同浓度染毒组的CaMmRNA表达水平与对照组比较，差异均无显著性（P＞0.05）。（2）CaM免疫组化及Western blot结果：免疫组化结果提示CaM在淋巴细胞的胞膜、胞浆、胞核内部均有表达。Western blot检测结果表明，染毒12h后，10^-4M PbCl₂染毒组的CaM的蛋白表达量明显下降，与对照组比较差异有显著性（P＜0.05），而其它不同浓度染毒组CaM水平与对照组比较，差异均无显著性（P＞0.05）。（3）CaMmRNA与CaM表达水平的相关性：经Spearman相关性检验CaMmRNA与CaM表达水平之间无统计相关性（P＞0.05）。结论（1）Pb²⁺染毒淋巴细胞时，低浓度刺激CaMmRNA的表达，高浓度抑制表达；（2）10^-4MPbcl₂染毒淋巴细胞时，抑制CaM蛋白的表达。第三部分铅染毒对淋巴细胞增殖及分泌IL-2的影响研究目的探讨不同浓度Pb²⁺染毒对淋巴细胞增殖及IL-2分泌的影响。研究方法（1）研究对象：小鼠脾淋巴细胞悬液，体外给予不同浓度Pb²⁺染毒。（2）采用MTT法检测不同浓度Pb²⁺染毒后对淋巴细胞增殖的影响。（3）采用ELISA法检测不同浓度Pb²⁺染毒后对淋巴细胞培养上清液中IL-2的影响。结果（1）不同浓度Pb²⁺染毒对淋巴细胞增殖的影响：与对照组比较，10^-6M染毒组对淋巴细胞的增殖指数无明显影响，差异无显著性（P＞0.05）；10^-4、10^-5MPbCl₂在染毒24h时，淋巴细胞增殖指数与对照组比较明显下降，差异有显著性（P＜0.05）。（2）不同浓度Pb²⁺染毒对淋巴细胞IL-2分泌的影响：染毒12h，10^-4M PbCl₂染毒组与对照组比较，淋巴细胞IL-2分泌明显下降，差异有显著性（P＜0.05）；当染毒至24h时，10^-5M、10^-4M PbCl₂染毒组的淋巴细胞IL-2分泌水平均明显下降，与对照组比较差异有显著性（P＜0.05）；10^-6M PbCl₂染毒组与对照组比较差异无显著性（P＞0.05）。（3）淋巴细胞增殖指数与培养上清中IL-2的相关性分析：Pb²⁺染毒24h组的淋巴细胞增殖指数与IL-2分泌水平呈正相关（r=0.65．p=0.022）。结论（1）10^-4-10^-5M PbCl₂染毒对淋巴细胞增殖及IL-2分泌具有抑制作用；（2）10^-4MPbC1₂染毒淋巴细胞后的细胞增殖指数与IL-2的分泌水平存在正相关。