药用植物何首乌(Fallopia multiflora Thunb.)是著名的传统大宗中草药材,其具有补肝肾、益精血、乌须黑发、养心安神等功效。何首乌的主要化学成分包括二苯乙烯类(stilbenes)、蒽醌类(anthraquinones)、磷脂类(lecithin)。其中最重要的就是其主要药效成分二苯乙烯苷,即2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖甙(2,3,5,4’-tetrahydroxystibene-2-O-β-D-glucoside, TSG)。现代药理学已经证实二苯乙烯苷具有抗菌、消炎、抗肿瘤、酪氨酸酶抑制等多种生物活性,并在降血脂、抗衰老、保护心血管及抗动脉粥样硬化等方面有很好的应用前景。目前国内外对何首乌中二苯乙烯苷的生物活性,药理作用等研究较为透彻,而对其在何首乌中的代谢合成途径和关键酶、基因的研究却未见报道。同时由于二苯乙烯苷在何首乌药材中的含量较为微少,其含量变化具有组织特异性,时序性,和空间限制性,限制了其广泛应用。对二苯乙烯苷在何首乌中合成关键酶、基因的研究将为后续利用次生代谢工程调节二苯乙烯苷产量、满足人类日益增长的药用保健需求及植物防御、作物品质改良提供帮助。同时也是对植物二苯乙烯类次生代谢物质合成,调控机制的丰富和发展。因此对何首乌中二苯乙烯苷合成途径中相关酶、基因的研究具有十分重要的意义。已有研究表明白藜芦醇等二苯乙烯类物质来源于苯丙氨酸途径。苯丙氨酸代谢途径,起始分子为苯丙氨酸,在苯丙氨酸解氨酶(PAL)的催化下产物为肉桂酸(Cinnamic acid);接下来肉桂酸4-羟基化酶(C4H)在肉桂酸的对位点上催化位置特异性的羟化反应,将反式肉桂酸催化生成对-香豆酸,是为苯丙氨酸途径的第二步反应。而4-香豆酸辅酶A连接酶(4CL)作用于苯丙酸途径中最后一步反应,催化各种羟基肉桂酸生成相应的硫酯包括肉桂酰辅酶A和香豆酰辅酶A。白藜芦醇等二苯乙烯类物质的二苯乙烯母核是以苯丙氨酸途径产生的香豆酰辅酶A和丙二酰辅酶A和为底物,由二苯乙烯合成酶(stilbene synthase, STS)催化合成,再经修饰、聚合等作用形成结构不同的二苯乙烯类物质。可见二苯乙烯合成酶是许多二苯乙烯类物质合成的关键酶。而何首乌中是否存在二苯乙烯合成酶,以及该酶是否与二苯乙烯苷的合成相关还不清楚。为了深入研究何首乌中二苯乙烯苷的生物合成途径中相关酶、基因,为今后利用基因工程技术提高二苯乙烯苷类的含量满足药用保健需求奠定基础,同时也为进一步了解植物二苯乙烯类物质合成调控机制,本课题针对何首乌中的二苯乙烯合成酶基因进行研究。目的和意义：克隆何首乌中的二苯乙烯合成酶基因并进行酶催化反应鉴定,研究二苯乙烯合成酶基因在何首乌各组织的表达与二苯乙烯苷表达的关系,为研究二苯乙烯合成酶基因在二苯乙烯苷合成及其调控中的功能、二苯乙烯苷生物合成途径以及今后利用基因工程技术提高二苯乙烯苷类的含量满足药用保健需求奠定基础。研究方法和内容：1.何首乌总RNA的提取及反转录取何首乌的新鲜块根用百泰克RNA提取试剂盒抽提RNA,以Oligo dT18为引物按Roche反转录试剂盒说明书进行cDNA第1条链的合成。2.何首乌二苯乙烯合成酶基因cDNA全长序列的获得依据STS基因家族的蛋白保守区域,主要是何首乌近缘物种大黄和虎杖等的STS基因序列设计引物,以获得的cDNA为模板,PCR扩增何首乌STS的保守区片段。根据STS保守区测序结果设计RACE特异性引物。利用提取的RNA,采用Invitrogen公司的5’RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version2.0试剂盒获得该基因的5’端序列。采用Clontech公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒获得该基因的3’端序列。两端RACE的第二轮扩增产物进行胶回收纯化、连接至PMD-18T,转化后挑取阳性克隆测序。拼接后获得何首乌STS基因cDNA的全长序列。命名为FmSTS2,获取GeneBank登录号。3.FmSTS2的原核表达以何首乌cDNA为模板,扩增FmSTS2的开放阅读框。将纯化回收的PCR产物与和表达载体pET28a用T4DNA连接酶连接,使FmSTS2N端融合pET28a(+)载体上的6×His标签,可以高度亲和Ni2+。转化BL21感受态细菌,涂布含50mg/L卡那霉素(Kan)的固体LB平板。长出的菌落进行菌落PCR鉴定和测序验证。挑取阳性单克隆,用含Kan的LB液体培养基37℃,200rpm振荡培养,OD600=0.6时,加入1mM IPTG诱导蛋白表达。首先将诱导温度设为30℃,将菌液分别诱导4h、5h、6h、7h、8h、9h后,离心收集菌体,用2ml磷酸钾缓冲液(PH=7.5)悬浮,冰上超声10min,离心后取上清进行可溶性蛋白的SDS-PAGE分析,得到最佳诱导时间。在最佳诱导时间的条提下,SDS-PAGE检测诱导温度分别为20、23、25、28、30、35℃时可溶性蛋白的表达情况。4.融合蛋白的分离纯化按照得到的最佳诱导温度和时间诱导菌液表达可溶性蛋白,将超声过的菌液4℃条件下10,000g离心10min。上清液过Ni-NTA亲和树脂层析柱纯化融合蛋白。用含有0.5m NaCl和40mM咪唑的0.1M的磷酸钾缓冲液(pH7.5)平衡柱子后用含有400mM咪唑的0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)洗脱洗脱重组蛋白。收集洗脱下来的组分并进行SDS-PAGE检测。将纯化的蛋白溶液透析过夜后置于-80℃,冷冻成冰后置于冻干机中真空冷冻干燥成粉末。5.酶活性鉴定反应体系包括150μM的香豆酰辅酶A,280μM的丙二酰辅酶A,10μg纯化后的重组蛋白和0.1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)共250μL。35℃条件下孵育30分钟。反应产物用250μL的醋酸乙酯萃取两次,真空干燥后,用50μl的80%(v/v)乙醇溶解作为待测液。采用HPLC进行酶催化产物的分析。色谱条件：迪马C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相为乙腈-水(25：75)；流速1ml/min;检测波长306nm；柱温25℃；进样量10μl。6.HPLC检测何首乌各个组织二苯乙烯苷含量取同一株何首乌的块根,老藤,茎,叶片液氮研磨成粉末置于55℃烘干25h。过80目筛,取粉末0.2g溶于25ml50%乙醇冷浸过夜,0.45μM滤膜过滤待测。0.004g标准品二苯乙烯苷溶于10ml(50%乙醇)作为对照品,过滤待测。色谱条件：迪马C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相乙腈-水(25：75)；流速1ml/min;检测波长320nm,柱温25℃；进样量10μ1。7.RT-PCR检测FmSTS2在何首乌各个组织的表达按1法分别对6中同一株何首乌的块根,老藤,茎,叶进行RNA的提取和反转录。将各组织的cDNA总量调成50ng/μl,分别进行PCR扩增FmSTS2。 ActinⅠ作为内参。主要结果：1.何首乌STS保守区的扩增和全长的获得扩增何首乌二苯乙烯合成酶基因保守区,测序得到780bp左右大小的片段。根据该序列设计引物,5’RACE电泳结果显示在850bp左右得到目的条带；3’RACE电泳结果显示在250左右扩增得到目的条带,将PCR产物回收克隆T载体后进行测序,通过序列拼接获得含有一个完整编码区的基因序列,命名为FmSTS2(GenBank登录号为：JX914503),全长cDNA序列为1644bp,包括441bp的5’非翻译区(UTR),66bp的3’UTR1137bp的ORF,编码378个氨基酸。预测蛋白分子量大小为42kDa。2.FmSTS2基因的原核表达和鉴定SDS-PAGE电泳结果显示,经IPTG诱导的空白对照菌无目的蛋白条带产生,可溶性的重组蛋白在42kDa处出现条带,并且随诱导时间的增加而增加,但到7h时表达量达到最大。而可溶性蛋白在28℃之前表达量依次增多,到28℃达到最大值。HPLC色谱图显示,酶催化产物供试液与白藜芦醇对照品具有相同的保留时间峰(13.24min)。说明催化产物主要为白藜芦醇,说明原核表达蛋白具有二苯乙烯合成酶的活性。说明克隆的酶基因为二苯乙烯合成酶基因。3.何首乌中FmSTS2的表达和二苯乙烯苷含量的关系分析HPLC结果经分析之后得到二苯乙烯苷在何首乌中各个组织的含量。结果显示块根中二苯乙烯苷含量最高(3.37%),老藤其次(0.78%),而茎(0.06%)和叶(0.007%)中的含量很低。RT-PCR检测FmSTS2基因在何首乌不同组织中的表达,电泳结果表明,作为内参的细胞核基因ActinⅠ在何首乌各个组织表达一致,而FmSTS2在块根中的表达量最高,其次是老藤,在幼茎和叶片中表达微量。主要结论：从传统中药材何首乌的块根中克隆到一种二苯乙烯合酶FmSTS2,其互补cDNA全长1644bp,成功构建原核表达系统,表达的重组蛋白具有催化合成二苯乙烯类物质白藜芦醇的活性。该基因在何首乌不同组织中均有表达,其中在块根中表达量最高,老藤和茎次之,叶片中最低,即二苯乙烯苷的积累模式与FmSTS2基因在何首乌不同组织中的表达高低情况一致。这表明FmSTS2很可能在二苯乙烯苷的合成中起一定作用,但其在何首乌中二苯乙烯类物质代谢中的具体功能仍需进一步的研究。这为后续研究二苯乙烯合成酶基因在何首乌二苯乙烯苷合成及其调控中的功能、二苯乙烯苷生物合成途径以及今后利用基因工程技术提高二苯乙烯苷的含量满足药用保健需求奠定基础。