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研究背景神经干细胞(NSCs)具有自我更新和分化的功能。有研究报道通过移植体外培养的NSCs来治疗神经退行性疾病的研究取得了很大进展,但临床效果不佳。NSCs移植进入大脑之后细胞存活受限,且存在免疫排斥等弊端,通过促进内源性NSCs的分化或许是治疗神经退行性疾病有效方法之一。雷帕霉素具有抗真菌和抗癌的作用,参与机体的稳态维持等过程。有研究报道雷帕霉素可以通过激活自噬促进间充质干细胞成骨分化能力。雷帕霉素对NSCs分化有怎样的影响仍不是很清楚。蛋白质组学是利用质谱技术研究细胞、组织中蛋白质组成及其变化的科学。蛋白质组学已成为很多研究领域的重要方法之一。在本研究中,我们对神经干细胞及雷帕霉素(0、200 nM)处理的神经干细胞分化进行基于质谱的蛋白质组学检测分析,以探究雷帕霉素对NSCs分化的影响,筛选差异蛋白,并初步探讨其作用机制。研究目的本实验设计旨在研究NSCs分化前后及雷帕霉素对NSCs分化的影响并初步探讨其作用机制,为NSCs在神经退行性疾病中的应用提供更深入的理论基础。方法1.原代培养:分离出来自C57BL/6小鼠的海马组织中单个细胞进行原代培养。待神经球边界清晰,球中央部分折光度变低,细胞即可传代。2.传代培养:采用Accutase酶消化细胞,传代至新的培养皿中,每隔2天半量换液。3.NSCs鉴定:采用免疫荧光方法鉴定NSCs的标志物Nestin的表达及流式细胞术检测其纯度。4.NSCs分化:采用免疫荧光方法鉴定NSCs分化7天后,神经元早期标志物Tuj-1蛋白的表达。5.蛋白质组学检测:采用蛋白质组学方法对NSCs传代后第5天、NSCs诱导分化、同时经雷帕霉素处理(0、200 nM)第5天,对这三组细胞进行基于质谱的蛋白质组学检测分析。6.凋亡检测:采用Hoechst33342和碘化丙啶(PI)双染方法检测分化后的NSCs,同时经雷帕霉素处理(0、200 nM)5天两组细胞的凋亡情况。结果1.分离出来自海马区NSCs,培养3天后开始形成神经球,每5-7天传代一次。2.免疫荧光结果表明培养的NSCs表达Nestin蛋白。流式细胞术结果表明NSCs中表达的Nestin阳性细胞率为96%。3.免疫荧光结果显示NSCs分化后第7d有神经元早期标志物Tuj-1蛋白的表达。4.蛋白质组学结果显示神经干细胞分化后神经祖细胞Sox2蛋白表达降低了 1.4倍,神经元Tuj-1和Map2蛋白表达增加了 2.8倍和1.5倍,突触蛋白1 Synapsin1和突触蛋白2Synapsin2表达升高了 1.8倍和1.4倍,星形胶质细胞GFAP蛋白表达升高了 5.5倍,少突胶质祖细胞Olig2蛋白表达降低了 3.171倍,少突胶质细胞Galc和CNPase蛋白表达升高了 2.5倍和1.5倍。雷帕霉素处理后神经元Tuj-1蛋白表达降低了 1.7倍,星形胶质细胞GFAP蛋白表达无差异,少突胶质祖细胞Olig2蛋白表达无差异,少突胶质细胞CNPase蛋白表达升高了1.2倍,突触蛋白1和突触蛋白2表达降低了 1.558倍和1.227倍。凋亡相关蛋白Apaf-1表达降低了1.2倍、凋亡相关蛋白Caspase-3表达降低了 1.4倍,凋亡相关蛋白Caspase-6表达降低了 1.2倍。长寿蛋白Sirt3表达升高了 1.4倍。除此之外,雷帕霉素处理后上调的差异蛋白被富集到20条信号通路,排名前三的是氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、阿尔茨海默病(Alzheimer disease)和帕金森病(Parkinson disease)信号通路。其中,氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)中5个复合物中均有蛋白表达升高了 1.2倍以上。5.凋亡试剂盒检测结果表明,神经干细胞分化过程中经雷帕霉素处理后,细胞凋亡率降低(P<0.01)。结论1.在神经干细胞分化过程中,雷帕霉素降低了神经元Tuj-1蛋白的表达,增加了少突胶质细胞CNPase蛋白表达,而星形胶质细胞GFAP蛋白表达没有变化。2.在神经干细胞分化过程中,雷帕霉素上调了氧化磷酸化水平,增加了长寿命蛋白Sirt3的表达,降低了细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-6和Apaf-1的表达。