研究背景及目的SHIP2(src-homology 2-containing inositol 5–phosphatase 2)是多磷酸肌醇-5-磷酸酶家族成员之一,已有研究证实其在Ⅱ型糖尿病、关节硬化及多种肿瘤等人类疾病中具有一定的作用。然而,关于SHIP2在胃癌中的作用迄今尚无相关报道。本课题组的前期研究发现,相对于正常胃黏膜上皮细胞,SHIP2在胃癌细胞中的表达普遍较低,并且低表达的SHIP2可能通过激活PI3K/Akt信号通路促进了胃癌的发生发展。本研究在此基础上,旨在进一步探讨SHIP2分子在胃癌细胞下调表达的分子机制。方法采用实时荧光定量PCR检测正常胃黏膜上皮细胞和一组胃癌细胞株SHIP2基因拷贝数变化。全外显子测序法检测SHIP2外显子突变情况。分别采用10μM DNA甲基化抑制剂5-aza-d C和5μM广谱组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA处理胃癌细胞和正常胃黏膜上皮细胞,western blot检测SHIP2蛋白水平;亚硫酸氢钠处理后测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测SHIP2基因启动子区甲基化水平。双荧光素酶报告基因分析系统检测SHIP2基因启动子区最小转录活性区域;利用生物信息学对最小转录活性区域进行分析,寻找可能的转录因子结合位点,并对该转录因子结合位点进行定点删除,双荧光素酶报告基因分析系统检测转录因子Sp1对SHIP2的转录激活作用。分别采用实时荧光定量PCR和western blot检测正常胃黏膜上皮细胞和一组胃癌细胞株中SHIP2和Sp1的m RNA和蛋白表达;采用免疫组化法检测正常癌旁组织和胃癌组织中SHIP2和Sp1的表达。对Sp1表达较低的胃癌细胞株SGC-7901和MGC-803瞬时转染Sp1c DNA,克隆形成试验和MTS检测细胞生长和增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,细胞划痕试验检测细胞迁移,transwell试验检测细胞侵袭。染色质免疫共沉淀试验(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)证实Sp1与SHIP2的结合,实时荧光定量PCR检测瞬时转染Sp1后SHIP2 m RNA的表达情况。结果1)与正常胃黏膜上皮细胞相比,SHIP2在胃癌细胞中的基因拷贝数变化无统计学意义;除HGC-27细胞外,其他胃癌细胞株SHIP2外显子均发生不同程度的碱基突变和缺失;5-aza-d C可上调胃癌细胞SHIP2的表达,但SHIP2基因启动子区Cp G岛的甲基化频率很低;SHIP2启动子区最小转录活性区域在-111~-63bp,生物信息学分析发现此区域存在两个Sp1的结合位点,对该位点定点删除后,SHIP2的转录活性明显下降。2)与正常胃黏膜上皮细胞相比,SHIP2和Sp1在胃癌细胞中的表达均明显降低。3)在胃癌细胞中过表达Sp1,抑制了细胞的生长增殖、迁移和侵袭,促进了细胞的凋亡。4)在胃癌细胞中过表达Sp1,SHIP2的转录表达明显增强。结论转录因子Sp1在胃癌细胞中的下调表达,抑制了SHIP2的转录激活,是促进胃癌细胞恶性生物学行为发生的重要机制之一。