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目的合成并筛选针对HPV16E7基因有效的siRNA,探讨其对HaCaT-E7细胞中HPV16E7 mRNA、TAP1及细胞表面HLA-Ⅰ类分子表达的影响。方法1.siRNA的合成和筛选化学法合成3条HPV16 E7特异性siRNA,应用转染试剂Lipofectamine 2000将其转染入HaCaT-E7细胞,24h后收集细胞,TRIZOL法提取细胞总RNA,以Oligo dT为引物将RNA逆转录为cDNA,以管家基因β-actin为内参照,实时荧光定量PCR检测HPV16 E7 mRNA的表达水平,分析各个siRNA的作用效果,筛选出抑制效果最好的siRNA。2.siRNA转染对数生长期正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞应用转染试剂Lipofectamine 2000分别转染siRNA2,同时设立非特异性siRNA对照和空转染对照。转染4h后更换完全培养基,于37℃,5%CO2条件培养细胞,用于不同时间点的检测。3.流式细胞术检测细胞膜表面HLA-Ⅰ类分子的表达正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞、HaCaT-pCMV细胞转染siRNA 24h、48h、72h后,收集细胞,检测其细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达。0.25%胰酶消化后,用含1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS（PBS-B）重悬,加入20μL抗HLA-ABC-FITC或抗KLH-FITC（同型对照）,混匀后避光静置20min,2mL PBS-B冲洗,400μL PBS-B重悬,流式细胞仪检测。4.流式细胞术检测细胞内部抗原处理相关转运蛋白TAP1的表达正常HaCaT细胞、HaCaT-E7细胞转染siRNA72h后,0.25%胰酶消化,Fixation/Permeabilization破膜处理,PBS-B重悬,20μL鼠抗人TAP1单克隆抗体作用30min,Perm/Wash buffer冲洗,1:100稀释的羊抗鼠IgG-FITC抗体重悬,暗室涡旋混匀30min,Perm/Wash buffer冲洗两遍,400μL PBS-B重悬,上机检测。以荧光二抗为同型对照。结果1.RT-PCR反应结束得到循环阈值（Ct值）,用相对定量的方法(2-ΔΔCT)来分析各组细胞转染siRNA后HPV16 E7 mRNA的表达。与空转染对照相比,siRNA1、siRNA2和siRNA3均能有效抑制HPV16 E7 mRNA的表达,但其抑制效果不同,其中以siRNA2作用效果最明显,抑制率达75%。2.细胞膜表面HLA-Ⅰ类分子表达的检测:正常HaCaT细胞、HaCaT-pCMV细胞、HaCaT-E7细胞分别转染siRNA2、非特异性siRNA24h、48h、72h后,流式细胞术检测各组细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达。HaCaT-E7细胞转染siRNA2后,细胞表面HLA-Ⅰ类分子表达水平随时间延长逐渐升高,72h的表达高于空转染对照组30%,差异具有统计学意义（P＜0.01）。此外,HaCaT-E7细胞转染siRNA2 72h后,细胞表面HLA-Ⅰ类分子表达水平与正常HaCaT细胞相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。而正常HaCaT细胞和HaCaT-pCMV细胞在转染siRNA前后,细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达差异均无统计学意义（F=0.01,F=0.03,P＞0.05）。3.细胞内部TAP1表达水平的检测:HaCaT-E7细胞转染siRNA2、非特异性siRNA 72h后,流式细胞术检测细胞内部TAP1的表达,同时测定正常HaCaT细胞内部TAP1的水平作为对照。结果显示,HaCaT-E7细胞转染siRNA2后,TAP1表达水平升高,与空转染对照组和非特异siRNA组相比,均有统计学意义（P＜0.01）,与正常HaCaT细胞组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论1.化学合成的HPV16 E7特异性siRNA能有效抑制HaCaT-E7细胞中E7mRNA的表达,不同序列siRNA的抑制效果不同。2.siRNA抑制HaCaT-E7细胞中E7 mRNA表达后,可使HaCaT-E7细胞表面HLA-Ⅰ类分子的表达随时间上调,72h时达正常HaCaT细胞水平,预示着siRNA干扰技术可增加CTL对HPV感染细胞的清除机会,增强细胞的免疫原性。3.siRNA抑制HPV16 E7 mRNA表达后,HaCaT-E7细胞内部TAP1表达水平升高,72h时达正常HaCaT细胞水平。靶向人乳头瘤病毒HPV16 E7的siRNA干扰技术为宫颈癌的基因治疗提供了新的方案。