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缺血性心脏病是目前发病率和死亡率较高的疾病之一,由于冠状动脉狭窄和闭塞导致供血区域的心肌细胞缺血缺氧而坏死,梗死区逐渐被纤维疤痕所替代,影响心脏局部的收缩和舒张功能,致使左心室腔内血液不能有效排空,心室内压增高,发生左心室扩张,随着左室重构的进一步发展,逐渐出现充血性心力衰竭。目前缺血性心脏病主要的治疗措施包括药物治疗、介入治疗、冠状动脉旁路移植术、以及心脏移植等。上述治疗虽已取得很大的进步,但仍有很多患者因病变血管弥散或手术风险高等原因,不能进行上述治疗或者效果不佳。通过基因转染或细胞移植促进梗死区局部的血管新生,给缺血性心脏病患者提供了一种全新的治疗策略。 目前血管生长因子基因治疗仍是缺血性心脏病治疗研究的一个热点。这方面的研究主要集中于血管内皮细胞生长因子(VEGF)基因、成纤维细胞生长因子(FGF)基因等,并已证实它们具有促进缺血心肌血管新生的作用。但是,以内皮祖细胞为载体表达 VEGF 基因是否能够增强移植细胞功能并进一步促进缺血心肌再血管化尚未见报道。本实验将构建携带 VEGF165基因的复制缺陷型腺病毒载体 Ad.VEGF165,同时诱导培养大鼠骨髓内皮祖细胞,用 Ad.VEGF165在体外转染骨髓内皮祖细胞并检测其转染效率、蛋白表达及对内皮祖细胞的促增殖及分化作用,在体外研究的基础上,将转染Ad.VEGF165 后的内皮祖细胞移植到大鼠缺血心肌,观察移植细胞的存活,及其对于促进血管生长、增加血流灌注、改善心功能的协同治疗作用。本课题主要研究方法:1、人血管内皮细胞生长因子 基因重组腺病毒(Ad.VEGF165)的构建 165 应 用 磷 酸 钙 共 沉 淀 法 将 携 带 VEGF165 基 因 的 重 组 腺 病 毒 粘 粒 载 体pAxCAwt.VEGF165,及腺病毒基因组末端蛋白 DNA-TPC 制备 Ad.VEGF165 重组腺病毒,通过腺病毒粘粒载体 pAxCAwt 公共引物对重组腺病毒 DNA 进行 PCR 检测及酶切鉴定,将鉴定好的病毒克隆进一步扩增、纯化和测定滴度。2、体外分离大鼠骨髓单核细胞并诱导培养内皮祖细胞 通过 Ficoll 密度梯度离心分离大鼠骨髓单核细胞,差速贴壁后置于纤维连接素包 - 2 -<WP=7>第二军医大学博士学位论文 中文摘要 胸心外科专业被的培养皿中加入条件培养基进行诱导培养。通过倒置相差显微镜观察培养细胞的生长状态,采用 CD31、CD34、VRGFR-2、Ⅷ因子免疫组化和 BS1-Lectin 结合能力鉴定培养细胞类型,流式细胞仪检测培养细胞的纯度,透射电镜观察细胞超微结构和内皮细胞特征性细胞器。3、Ad.VEGF165 转染 EPCs 后 VEGF 的表达、分泌及促 EPCs 增殖及分化作用的研究 以不同 MOI 值的 Ad.LacZ 转染体外培养的内皮祖细胞,通过 X-Gal 染色测定转染效率,确定最佳转染倍数。以免疫组化染色、 Western-blot 和 ELISA 检测转染 Ad.VEGF165后目的蛋白在细胞内的表达及细胞外的分泌情况;用 MTT 法检测 Ad.VEGF165转染后对 EPCs 的促增殖作用;将转染后的 EPCs 种植于细胞外基质 Matrigel 上,观察细胞分化情况。4、转染 Ad.VEGF165 的 EPCs 移植于心肌缺血梗死区的实验研究 实验动物为同基因背景的 Lewis 大鼠 64 只,随机分为 4 组,每组各 16 只大鼠,结扎左冠状动脉前降支建立急性心肌梗死模型,10 分钟后进行细胞移植,实验前移植细胞先以 PKH-26 和 BrdU 进行双标记:组Ⅰ移植转染 Ad.VEGF165的 EPCs;组Ⅱ单纯移植 EPCs;组Ⅲ注射 Ad.VEGF165;组Ⅳ注射 PBS。手术后 7 天荧光显微镜及免疫组化染色观察移植细胞的存活率、VEGF 蛋白的表达及缺血区心肌细胞凋亡的情况;术后 28 天抗 BrdU 及抗Ⅷ因子免疫组化染色评价移植细胞分化、心肌血管再生状况,心脏超声及在体血流动力学检测评价心脏的大小及收缩、舒张功能,本课题主要结果:1、建立了安全、稳定、有效的复制缺陷重组腺病毒 Ad.VEGF165 的构建方法。转染效率高、毒性低,体外使用安全。2、体外分离诱导培养的大鼠骨髓内皮祖细胞,经免疫组化及流式细胞仪鉴定纯度较高,透射电镜检测发现内皮细胞特征性细胞器 W-P 小体,并可以结合 BS1-Lectin 及分泌一氧化氮,具有成熟血管内皮细胞的某些特征。3、腺病毒对细胞有很高的转染效率,MOI 值为 50 时,转染率达 95%以上。Ad.VEGF165转染细胞后 72h 的免疫组化和 Western blot 检测显示细胞内有目的蛋白表达;ELISA 检测显示细胞培养上清中有 VEGF 分泌;MTT 检测显示 Ad.VEGF165转染后对 EPCs 有明显的促增殖作用;转染后的 EPCs 生长于细胞外基质(Matrigel Matrix)上时,出现分化,细胞相互连接成毛细血管网络样结构,说明 Ad.VEGF165转染能在体外条件下诱导EPCs 的分化,刺激血管发生。 - 3 -<WP=8>第二军医大学博士学位论文 中文摘要胸心外科专业4、建立的大鼠急性心肌梗死模型简便可靠。实验各组细胞移植后 7 天的检测结果显示:移植的 EPCs 在移植区可存活,经 Ad.VEGF165转染的移植细胞存活数量较多(P<0.01);移植区有明显 VEGF 蛋白的表达;同时在很大程度上减少了缺?