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[目 的]对云南省大理市片形吸虫的种类进行分子鉴定,并对其部分线粒体DNA序列进行研究,旨在从分子水平上揭示我国云南省大理市片形吸虫的种类、遗传结构及生物学特性。[方法]1、收集成虫样品及形态学鉴定：片形吸虫成虫取自云南省大理市病牛的肝胆管内,根据体形、肩部特征、虫体的长宽比例、肠管的分支等形态学特点将其初步分成两种,即肝片形吸虫与巨片形吸虫。2、基因组DNA的提取及鉴定：取一个虫体的1/3,用生理盐水反复进行冲洗,再用超纯水反复冲洗4-5次,置于一已消毒的1.5m1的离心管中。用组织剪尽可能的将虫体剪成碎块后再用组织研磨仪进行充分研磨,加入Buffer GL 180μl、Proteinase K 20μl、RNase A10μl,将得到的组织混合液置于56℃水浴箱中过夜,按照TaKaRa MiniBest Universal Genomic DNA Extraction KitVer.5.0试剂盒说明书提取基因组DNA,并用紫外分光光度计检测其纯度,于-20℃冰箱保存。3、PCR扩增及测序：用PCR扩增技术对片形吸虫核糖体ITS-2及线粒体cox1、nadl、nad5基因序列进行扩增,并将PCR产物送至昆明硕擎生物科技公司进行测序。4、序列分析及构建系统进化树：用DNAStar7.0软件将得到的序列与已报道的片形吸虫核糖体ITS-2线粒体cox1、nadl、nad5基因序列进行相似性比较,并用MegAlign软件对线粒体cox1、nadl、nad5基因序列构建系统进化树。[结果]1、以核糖体ITS-2作为遗传标记将来自云南省大理市的6个片形吸虫样品鉴定为两种,即肝片形吸虫和巨片形吸虫。2、获得了云南省大理市片形吸虫线粒体cox1、nadl、nad5片段的基因序列,经分子Marker(DL2000)和测序鉴定,三个基因片段大小分别为385bp、380bp、303bp,与预期目的基因大小相符。3、序列相似性分析显示各序列片形吸虫的种间分歧度分别为6.5%-7.4%、8.7%-9.4%、13.2%-14.8%;种内分歧度分别为0.3%-1.0%、0-2.6%、0.3%-3.6%。4、三个基因片段的分子进化树显示：云南省大理市肝片形吸虫样品与GeneBank中已发表的其它不同地域肝片形吸虫种株较紧密的聚集在一起,没有明显的分化；巨片形吸虫样品与其它不同地域巨片形吸虫种株较紧密的聚集在一起,分化不明显,但肝片形吸虫和巨片形吸虫种问分化则比较明显,且系统进化树显示结果与序列分析结果一致。[结论]1、云南省大理市至少存在肝片形吸虫与巨片形吸虫两种片形吸虫。2、云南省大理市片形吸虫存在着不同程度的遗传变异,其种内变异不明显,种间分化则比较显著。