程序性坏死在噬血细胞综合征中的意义及机制研究

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第一部分:非致死性噬血细胞综合征【目的】1)通过非甲基化CpG DNA片段反复刺激Toll样受体9构建非致死性噬血细胞综合征小鼠模型;2)检测模型小鼠中程序性坏死现象。【方法】8周C57/BL6小鼠随机分组,每组3只,实验组分别于第0、2、4、7、9天经腹腔注射2.5ug/g小鼠体重非甲基化的CpG DNA片段,对照组腹腔注射200ul PBS溶液。第9天处死取材,取全血送检血常规。采集各组小鼠脾脏拍照。采集各组小鼠肝脏,提取肝脏RNA进行逆转录,通过RT-PCR检测各组小鼠炎性细胞因子表达水平,主要包括IFN-γ、IL-10、IL-12。提取蛋白,通过Western blot检测各组小鼠肝脏程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3、MLKL及CC3水平。取部分肝脏进行冰冻切片和免疫荧光染色。【结果】实验组小鼠与对照组相比,血常规显示两系血细胞减少,脾脏明显肿大。RT-PCR结果显示肝脏组织中炎性细胞因子水平明显增高。Western blot结果显示肝脏程序性坏死相关蛋白表达异常,主要表现为胞质蛋白RIPK1减少,MLKL及CC3表达增高。肝脏冰冻切片免疫荧光染色显示RIPK1及MLKL表达增高。【结论】非甲基化的CpG DNA片段反复刺激Toll样受体9可以构建非致死性噬血细胞综合征小鼠模型,主要表现为外周血细胞减少,脾脏肿大,肝脏炎性细胞因子表达增高。此外,在实验组小鼠肝脏中发现程序性坏死现象。成功构建模型为以后的课题研究奠定了实验基础。第二部分:致死性噬血细胞综合征【目的】1)通过非甲基化CpG DNA片段联合半乳糖胺(DG)反复刺激Toll样受体9构建致死性噬血细胞综合征小鼠模型;2)检测模型小鼠中程序性坏死现象。【方法】5周C57/BL6小鼠随机分组,实验组5只,对照组3只,实验组于第0、2、4、7、9、11、14、16、18、21天经腹腔注射3ug/g小鼠体重非甲基化CpG DNA片段和0.30mg/g小鼠体重半乳糖胺,对照组小鼠腹腔注射200ul PBS溶液。第4、10、21天取材。外周血涂片进行Giemsa染色。采集各组小鼠脾脏拍照、称重,提取细胞进行Giemsa染色。采集各组小鼠股骨,一部分提取骨髓细胞进行Giemsa染色,一部分做石蜡切片进行HE染色。采集各组小鼠肝脏,一部分提取蛋白,通过Western blot检测各组小鼠肝脏程序性坏死相关蛋白RIPK1、RIPK3、MLKL及CC3水平。一部分做石蜡切片,分别进行HE染色、免疫组化染色。【结果】实验组部分小鼠第一天出现死亡现象。实验组小鼠与对照组相比,脾脏明显肿大。外周血、脾脏及骨髓组织中可见噬血细胞现象。骨HE染色提示骨髓细胞减少。Western blot结果显示肝脏程序性坏死相关蛋白表达异常,主要表现为胞质蛋白RIPK1减少,MLKL及CC3表达增高。肝脏HE染色提示单核细胞浸润及局灶性坏死。肝脏免疫组化染色显示坏死灶部位RIPK1、MLKL及CC3表达阳性。【结论】非甲基化的CpG DNA片段联合半乳糖胺反复刺激Toll样受体9可以构建致死性噬血细胞综合征小鼠模型,具体表现为部分小鼠注射药物后迅速死亡,存活小鼠表现为噬血细胞现象、脾脏肿大、肝脏大量单核细胞浸润及局灶性坏死和骨髓细胞减少。此外,在实验组小鼠肝脏中发现程序性坏死现象,免疫组化染色结果强烈提示程序性坏死参与肝脏损伤。由于肝脏衰竭是小鼠死亡重要原因,程序性坏死有望成为噬血细胞综合的潜在治疗靶点。
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