细菌性脑膜炎是新生儿时期最常见的中枢神经系统感染性疾病,近年来因有效抗生素的使用,死亡率虽有所下降,但其发病率仍保持相对不变,且近一半幸存者仍处于神经系统终生损伤和神经后遗症的高风险中。大肠杆菌K1（E.coli K1）菌株是导致新生儿脑膜炎发生的最常见革兰氏阴性菌,其毒力因子FimH是E.coli K1入侵人脑微血管内皮细胞（HBMEC）初始环节的最关键黏附因子,但也有研究者发现FimH在E.coli K1侵袭HBMEC的过程也发挥重要作用,而其机制并不完全清楚。同时,在E.coli K1侵袭人脑微血管内皮细胞过程中,FimH除了作为黏附/侵袭因子以外,是否对多形核粒细胞（PMN）募集和迁移具有调节作用以及可能的机制如何,目前均不清楚。CD48是FimH的受体,属于糖基磷脂酰肌醇（GPI）锚定蛋白,广泛分布于造血细胞和血管内皮细胞,与病原体的识别、细胞因子调节以及细胞激活密切相关。GPI锚定蛋白存在于细胞膜中由鞘糖脂、鞘磷脂、胆固醇等聚集形成的“脂筏（LRs）”中,该结构中富含大量与信号转导相关的信号分子。因此,CD48可通过与脂筏中相关信号分子的交联经共刺激信号来触发一系列信号级联反应从而实现信号的传导。我们的前期研究表明E.coli K1（FimH+）可诱导α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7 nAChR）—一种能够介导细菌侵袭和炎性通路的调节分子,在脂筏中的重分布。同时发现E.coli K1（FimH+）亦可诱导CD48在HBMEC脂筏中的重分布,并且CD48及α7 nAChR均向脂筏9个组分之中的同一组分聚集。在此基础上,我们提出以下假设:大肠杆菌K1可能是通过FimH与HBMEC上受体CD48结合,形成FimH/CD 48/α7 nAChR/LRs复合体,并以脂筏作为信号平台,经共刺激信号,引起HBMEC骨架蛋白重排并调节细胞黏附分子的表达,进而增强E.coli K1侵袭HBMEC和促进PMN迁移穿过血脑屏障。本研究的预期成果可能为临床防治新生儿细菌性脑膜炎提供新策略。本研究将从以下两方面验证以上假设。第一部分毒力因子FimH对E.coli K1及PMN穿过血脑屏障的影响目的:构建FimH基因敲除菌株—△FimH;构建pET28a-FimH1-156重组表达质粒;诱导表达并纯化获得重组融合蛋白FimH1-156;观察毒力因子FimH对E.coli K1侵袭HBMEC及其PMN迁移穿过血脑屏障的影响。方法:1.大肠杆菌菌株采用由新生儿脑膜炎脑脊液标本中分离得到的E.coli K1菌株RS218（O18:K1:H7）、具有利福平抗性的E44。以E44为出发菌株,用Red两步同源重组法构建FimH基因敲除菌株—△FimH:Lambda Red重组系统辅助质粒pKD46转化入RS218感受态细胞,制备RS218/pKD46电转化感受态细胞,将PCR构建的FimH基因打靶片段（含氯霉素抗性基因）转化入此感受态,氯霉素平板筛选发生同源重组的克隆,同时消除温度敏感的pKD46辅助质粒。PCR方法筛选FimH基因被氯霉素抗性基因取代的克隆,再次制备电转化感受态细胞,转化入Lambda Red重组系统辅助p CP20质粒,删除氯霉素抗性基因,并消除p CP20质粒,最终所得阳性克隆进行PCR产物电泳和测序验证;文中所用22A33菌株是由E44衍生而来的FimB Tnpho A插入突变株,该突变可导致包括FimH为主的所有I型菌毛基因失活。（由美国南加州大学洛杉矶儿童医院SHENG-HE HAUNG教授惠赠）;2.构建pET28a-FimH1-156重组表达质粒,以pET28a-FimH1-156重组表达质粒转化Transetta（DE3）感受态细胞,37℃、IPTG（终浓度0.4mmol/L）诱导4h后收集包涵体,分离获得纯化的FimH1-156蛋白;3.采用人脑微血管内皮细胞株（HBMEC）作为体外血脑屏障细胞模型,利用经典的庆大霉素保护方法,比较E44、22A33和△FimH对HBMEC侵袭能力的差异;4.采用Transwell体外细胞迁移模型检测E44、22A33或△FimH以及纯化的FimH1-156蛋白诱导PMN迁移穿过血脑屏障作用的差异。结果:1.经测序验证,成功构建了FimH基因敲除株E.coli K1 RS218/△FimH,所构建FimH基因敲除株命名为△FimH。2.成功构建了原核表达载体pET28a-FimH1-156,并诱导获得了高纯度的FimH1-156融合蛋白。3.细菌侵袭实验结果表明:22A33和ΔFimH菌株对HBMEC的侵袭率较野生株E44均降低了近50%,差异有统计学意义（p<0.001）。4.Transwell体外细胞迁移结果提示:与野生株E44相比,22A33和ΔFimH菌株诱导PMN穿过血脑屏障的作用明显减弱,差异有统计学意义（p<0.05）。结论:1.成功构建了FimH基因敲除E.coli K1 RS218菌株△FimH。2.成功构建了原核表达重组质粒pET28a-FimH1-156,并成功诱导表达获得了高纯度的FimH1-156融合蛋白。3.毒力因子FimH介导了E.coli K1对HBMEC的侵袭。4.毒力因子FimH能促进PMN迁移穿过血脑屏障。第二部分毒力因子FimH介导E.coli K1及PMN穿过血脑屏障的分子机制目的:明确钙信号是否参与E.coli K1菌株毒力因子FimH介导细菌及PMN迁移过程;探明FimH是否通过影响HBMEC肌动蛋白结合蛋白cofilin去磷酸化及黏附分子ICAM-1的表达进而介导E.coli K1侵袭及PMN迁移穿过血脑屏障;确定HBMEC上CD48和α7 nAChR之间是否具有互作关系。方法:1.检测E44、22A33对HBMEC细胞内钙离子浓度[Ca2+]i影响;钙调蛋白抑制剂三氟拉嗪TFP预处理对E44、22A33侵袭HBMEC和诱导PMN迁移的影响;2.免疫荧光和western blotting检测E44和ΔFimH对HBMEC上ICAM-1表达的影响;3.采用密度梯度离心法分离HBMEC脂筏,观察FimH+E44处理前后CD48及α7 nAchR在脂筏上分布的改变;4.免疫荧光检测E44、22A33及纯化的FimH蛋白对HBMEC上CD48和α7 nAchR表达及共定位影响;5.Western blotting检测E44、ΔFimH对HBMEC肌动蛋白结合蛋白cofilin去磷酸化的影响;6.免疫共沉淀方法检测外源性和内源性CD48和α7 nAChR是否具有相互作用关系。结果:1.E44处理使HBMEC[Ca2+]i明显升高,而22A33处理对HBMEC[Ca2+]i无明显影响。采用钙调蛋白抑制剂TFP预处理后,E44和22A33对HBMEC的侵袭率分别降低了48%和13%,组间差异有统计学意义（P<0.05）。TFP预处理亦可降低E44和22A33诱导的PMN的迁移率,与22A33组相比,TFP预处理后E44诱导的PMN的迁移率下降程度大于22A33组,组间差异具有统计学意义（P<0.05）。2.免疫荧光和western blotting结果显示,与ΔFimH处理组相比,E44处理可明显上调ICAM-1的表达,免疫荧光光密度平均值分别为19.546 vs 14.689（E44vsΔFimH）,western blotting条带灰度平均值分别为1.323 vs 0.793（E44 vsΔFimH）,差异有统计学意义（P<0.05）。3.脂筏分离结果:采用密度梯度离心法可将脂筏分为9个组分。对照组CD 48分布于脂筏的5～9组分。E44（FimH+）处理后,CD 48可部分分布于脂筏的1～4组分,尤其以第2组分最为明显。结合本课题组前期有关E44（FimH+）处理前后α7 nAChR重分布的研究结果,提示α7nAChR和CD48在E44处理后均出现于脂筏的第2组分,表明两者有互作的可能。4.免疫荧光双染结果:与22A33处理组相比,E44处理组中CD48和α7 nAChR的表达明显增强、两者在HBMEC中存在明显共定位。此外,纯化的FimH蛋白诱导的CD48和α7 nAChR在HBMEC表达及共定位结果与E44处理组一致。5.Western blotting结果显示:与ΔFimH处理组相比,E44处理组HBMEC的cofilin磷酸水平明显降低,即去磷酸化水平增强（去磷酸化为活化形式）。提示E.coli K1毒力因子FimH可诱导肌动蛋白结合蛋白cofilin去磷酸化活化。6.免疫共沉淀（Co-IP）结果:外源性的免疫共沉淀结果显示:在共转染Myc-CD 48和Flag-α7 nAChR真核表达载体的293T细胞中,anti-Myc Protein G-Agarose可沉淀Flag-α7 nAChR蛋白,anti-Flag Protein G-Agarose亦可沉淀Myc-CD 48;而相应对照组（转染Myc-CD48或Flag-α7 nAChR的相应空载）,均不能沉淀目的蛋白,表明外源性的α7 nAChR和CD48蛋白存在相互作用关系。内源性的免疫共沉淀结果显示:anti-α7 nAChR抗体在沉淀α7 nAChR蛋白的同时,亦能同时沉淀CD 48蛋白;反之,anti-CD 48抗体在沉淀CD 48蛋白同时,亦能同时α7 nAChR蛋白,表明HBMEC细胞中内源性的α7 nAChR和CD 48同样存在相互作用关系。结论:1.钙信号参与了毒力因子FimH促进大肠杆菌K1侵袭和PMN迁移穿过血脑屏障的过程。2.E.coli K1毒力因子FimH可上调HBMEC重要黏附分子ICAM-1的表达,从而促进PMN迁移穿过血脑屏障。3.E.coli K1毒力因子FimH可诱导HBMEC肌动蛋白结合蛋白cofilin去磷酸化活化,引起细胞骨架重排,进而有利于细菌的侵袭。4.在HBMEC中,CD48和α7nAChR具有互作关系,在脂筏中可形成FimH/CD48/α7nAChR复合体,激活钙信号转导,介导菌体黏附、入侵以及PMN迁移穿过血脑屏障。