论文部分内容阅读
雌激素受体(estrogen receptor,ER)是核受体超家族的成员之一,在正常乳腺发育及乳腺癌的发生、发展中起重要调节作用。雌激素(E2)通过与ER的结合,调节了多种靶基因包括影响乳腺细胞生长的相关生长因子的表达,已知2/3的乳腺癌的发生依赖于E2及ER。ER对基因表达的调控作用是受与之结合的许多辅调节蛋白影响的。在ER募集的辅调节蛋白中,除核受体辅激活蛋白和辅阻遏蛋白在转录水平调节雌激素应答基因的表达外,其他参与DNA修复的辅调节蛋白也可募集到ER以维持靶基因DNA的稳定性和完整性。因此,ER介导的转录调节与DNA修复密切相关。瓣状核酸内切酶(flap endonuclease 1,FEN1)就是新近发现的这类辅调节蛋白成员之一。FEN1是一种参与DNA修复的结构特异性核酸酶,参与了DNA复制时冈崎片段成熟及长片段碱基切除修复时有效去除5’端瓣状结构。最近的研究表明它在乳腺癌细胞中过表达,且与E2水平可能有关,FEN1可以直接与ER相互作用,通过提高ER与雌激素反应元件的结合,影响雌激素反应基因的表达,但目前有关E2影响乳腺癌组织中FEN1表达的分子机制及其生物学意义尚不十分清楚,为了明确E2在乳腺癌细胞中与FEN1之间的相关性,我们进行了如下研究:1、FEN1在乳腺癌组织/细胞和相应癌旁组织/正常细胞中的表达分析采用RT-PCR、Real-time PCR和Western blot方法发现FEN1在乳腺癌细胞MCF-7中的表达明显高于正常乳腺细胞MCF-10A;乳腺癌组织中FEN1的表达明显高于癌旁组织。2、E2对MCF-7乳腺癌细胞中FEN1表达的影响采用RT-PCR和Western blot方法证明在MCF-7细胞中,E2可上调FEN1的表达,并且在E2处理细胞约6小时时,FEN1表达量达最高。3、E2对MCF-7乳腺癌细胞中FEN1启动子活性的影响FEN1启动子重组报告基因质粒转染MCF-7细胞实验表明:E2可快速上调FEN1启动子活性,且这种上调作用可被ER拮抗剂ICI182,780和MAPK抑制剂U0126所抑制;TFSEARCH对FEN1基因启动子区的生物信息学预测显示,该区域没有直接的雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)位点,但存在4个潜在的血清反应元件(serum response element,SRE)位点/Elk-1结合位点;构建的Elk-1负显性表达质粒与FEN1启动子重组报告基因质粒共转染MCF-7细胞发现,E2上调MCF-7细胞中FEN1的启动子活性有赖于细胞中全长Elk-1。4、过表达FEN1对MCF-7乳腺癌细胞中ER的反式激活功能和细胞增殖的影响FEN1真核表达质粒与ERE重组报告基因质粒的共转染实验表明:过表达FEN1呈剂量依赖方式增强MCF-7细胞中ER的反式激活功能;FEN1真核表达质粒转染MCF-7细胞,稳定筛选和鉴定了FEN1过表达细胞株,MTT法进行细胞增殖分析表明:过表达FEN1可促进细胞的增殖。总之,本研究显示在乳腺癌细胞MCF-7中FEN1的表达量高于正常乳腺细胞MCF-10A,乳腺癌组织中FEN1的表达量高于相应癌旁组织;E2可上调FEN1的表达,并且这种上调作用与ER-MAPK-Elk-1途径相关;同时过表达FEN1可以剂量依赖的方式增强MCF-7细胞中ER反式激活功能;稳定过表达FEN1的MCF-7细胞株具有较高的增殖率。本研究结果表明在乳腺癌细胞中E2与FEN1密切相关,FEN1的表达受E2上调,其机制可能涉及了ER-MAPK途径对Elk-1的磷酸化,后者可能直接结合到FEN1启动子区的SRE位点,实现对FEN1表达的调控;而E2导致的过表达FEN1通过影响雌激素反应基因的表达,从而加速了乳腺癌的进程。本研究结果为进一步阐明E2上调乳腺癌细胞中FEN1表达的分子机制及其生物学意义奠定了基础。