稻瘟病作为严重的稻类疾病,感染稻类的叶、茎、梗甚至根处,传播十分迅猛,一旦感染某个地区,再也无法被根治。杀稻瘟菌素对霉菌和酵母菌有良好的抑制活性,防治稻瘟病的效果优于有机汞农药,在日本很快被用于替代制剂防治稻瘟病。目前,杀稻瘟菌素广泛应用于真核细胞转基因筛选研究中,具有良好的商业价值。Mark Zabriskie课题组克隆了杀稻瘟菌素的生物合成基因簇,测序并推导了它的生物合成途径,但由于其原始产生菌无法进行遗传操作,有关杀稻瘟菌素生物合成基因簇的基因功能所知甚少。杀稻瘟菌素（BS）生物合成过程中检测到中间代谢产物脱甲基杀稻瘟菌素（DBS）、亮氨酰脱甲基杀稻瘟菌素（LDBS）、亮氨酰杀稻瘟菌素（LBS）。前期研究证明:BS或者DBS被亮氨酰化后,毒性显著降低,推测亮氨酰化是生物合成过程中一种有效的自我保护机制;BS生物合成中的最后一个中间体LBS上的亮氨酸,最终因被水解而成熟为杀稻瘟菌素。本研究主要围绕鉴定与研究LBS水解酶如何将LBS成熟为BS,以期完善对杀稻瘟菌素生物合成途径的认识,并为其产量提高和组分转化提供理论依据。本研究前期通过染色体步移及对基因簇两侧可能的水解酶基因进行了系列突变,都没找到这个水解酶。偶然发现真菌和细菌的细胞粗提液（CFE）都能水解LBS为BS,证明了LBS水解酶基因广泛存在于杀稻瘟菌素生物合成基因簇外。通过蛋白的分级沉淀、质谱鉴定等方法找到5个潜在LBS水解酶,并最终从大肠杆菌中鉴定出Pep N为大肠杆菌中唯一降解LBS的水解酶。体内和体外的实验结果表明:Pep N的活性严格受p H的调控,p H=78时活性最高,p H<5或p H>10时逐渐失活,解释了不同批次发酵中BS和LBS产量和比例不稳定的现象。杀稻瘟菌素的异源表达菌S.lividans WJ2和原始产生菌S.griseochromogenes中以多组分的形式存在Pep N的同源蛋白Pep N1、Pep N2和Pep N3。体外生化实验表明,大肠杆菌融合表达的蛋白Pep N1、Pep N2和Pep N3都有LBS水解活性,并且Pep N1的活性是Pep N2及Pep N3的102倍至104倍;转录数据显示:pep N1:N2:N3=31:11:1,由此证明Pep N1是S.lividans WJ2和S.griseochromogenes的多组分LBS水解酶中的主要水解酶。在S.lividans WJ2中过量表达pep N1,可以将BS产量提高一倍,并在合适的发酵条件下将LBS和BS的比例由2:1降到2:3。为了了解多组分LBS水解酶在杀稻瘟菌素成熟过程中的作用,本研究构建了pep N1、pep N2和pep N3单独和组合缺失的七个突变株,突变株的全细胞和裂解液上清对LBS的水解效率测试再次证明Pep N1是主要的LBS水解酶。但发酵结果显示:S.lividans YGY14（△pep N1-N3）突变株的BS和LBS的产量、比例都与WJ2相近,表明链霉菌中还存在其他LBS水解酶,它们的活性可以被发酵培养基中的Mg2+、K+和Fe2+激活提高1倍至3倍。基于基因功能注释分析和体外生化实验,本研究证明了Pep A的微弱LBS水解活性,并根据条件优化后的饱和硫酸铵沉淀LBS水解活性组分的方法鉴定出24个其他潜在水解酶基因。杀稻瘟菌素的原始产生菌在p H<4的培养基中才分离到中间产物LBS,与此形成鲜明对比的是,异源表达菌株S.lividans WJ2的发酵液中总会有一些LBS残留;S.griseochromogenes的BS产量和CFE的LBS水解活性远远高于S.lividans WJ2。为了解释差异现象,本研究比较两者的主组分水解酶Pep N1的体外、体内活性及稳定性差异,却发现两者活性差异不大,并且在37℃的环境中放置30天以上都很稳定。监测两者发酵过程中的p H值,发现原始产生菌相比异源表达菌株,一直处于78最优发酵条件中,并从Pep N1的体内本底表达量比较,发现原始菌株中在发酵46天次级代谢产物产生时期Pep N1得到强表达,从而解释了LBS更高效地成熟为BS及产生更多BS的现象。为了提高杀稻瘟菌素的产量,本研究利用红霉素抗性基因启动子过表达的方式,系统性摸索了与已知潜在限速步骤相关的功能基因,包括单独过表达每一个基因簇的功能基因,提高前体cytosine、UDP-葡萄糖醛酸和Leu-t RNALeu的浓度,提高中间体LDBS的浓度等。最终通过在BS原始产生菌灰色产色链霉菌中串联过表达Bld A和亮氨酰t RNA合成酶,将摇瓶发酵产量从2.02 g/L提升至2.84 g/L,为杀稻瘟菌素的工业生产提供了指导性建议。