论文部分内容阅读
结核病（Tuberculosis,TB）为全球性传染病,呈逐年增高趋势,给人类带来极大的危害,人们称之为白色瘟疫。近二十余年来,人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和艾滋病（AIDS）已席卷五大洲156个国家。我国31个省市区均有HIV/AIDS报告,其蔓延势头令人震惊,HIV阴性者感染结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）,一生中发生结核病的几率占有10%左右,而HIV阳性者感染结核分枝杆菌后一生中发生结核病的几率增多至50%。结核分枝杆菌与HIV双重感染,无论HIV感染在前或者结核分枝杆菌感染在前,双重感染必然相互影响,相互促进,加速了结核病和艾滋病的发生和发展,预后险恶,病人短期内死亡,造成结核病疫情呈现全球性的回升。WHO报道,全球近三分之一的人已感染结核分枝杆菌,每年约有八百万新结核病人出现,死亡的人数达两百万人。如果结核菌感染得不到有效控制的话,预计从2002年到2020年,又将有十亿人感染结核菌。我国是世界上22个结核病高发国家之一,结核病人数居世界第二位,形势更为严峻。再加上90%结核菌感染者为隐匿感染,阻碍了结核病的诊治。结核病诊断的金标准是结核分枝杆菌的培养,但是其生长缓慢,如何使MTB快速培养成为研究热点之一。因此积极深入研究结核病的发病机制,找出更加有效的诊断、治疗和预防结核病的新技术、新方法和新疫苗具有深远的意义。复活促进因子（resuscitation-promoting factor,Rpf）是藤黄微球菌分泌的、可以在皮克水平以自分泌和旁分泌形式发挥促进休眠期细菌复活的蛋白质,为藤黄微球菌生长所必需。同源分析检索到结核分枝杆菌、谷氨酸棒状杆菌、麻风分枝杆菌和牛型结核分枝杆菌等富含GC的杆菌都具有与藤黄微球菌Rpf同源性很高的基因,且功能相似,类似真核生物的细胞因子,故被称为细菌的细胞因子。结核分枝杆菌H37Rv基因序列中Rv0867c（rpfA）、Rv1009（rpfB）、Rv1884c（rpfC）、Rv2389c（rpfD）、Rv2450c（rpfE）均编码类似于Rpf的蛋白,统称为Rpf样蛋白。它们具有很高的同源性,是约16KD的分泌蛋白,对刺激静息期细菌的生长起重要作用,因此推测对宿主体内潜伏休眠的结核分枝杆菌的复活起促进作用。分别敲除结核分枝杆菌基因组中的某一个Rpf基因时,其生长并没有受到明显影响,说明这一蛋白家族的功能有一定重叠,不是结核分枝杆菌生长所必需的,但从对数生长期到停滞期它们的表达模式不同,在特定的感染期每个Rpf基因的功能也不相同。为探讨Rpf样蛋白在其家族的生物功能及其对休眠期菌体的促生长作用,本课题克隆表达了Rpf基因中的Rv1884c和Rv0867c两个基因,并初步研究了其促生长作用,为研究Rpf样蛋白的其它功能打下基础。1、结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因的克隆表达及蛋白的纯化根据GenBank中结核分枝杆菌H37Rv基因组核酸序列（登录号:NC000962）检索出Rv1884c和Rv0867c基因的cDNA序列,用Primer Premier 5.0软件设计含EcoRⅠ、BamHⅠ和HindIII酶切位点的特异性引物。以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,利用热启动PCR方法分别扩增出两个目的基因片断。将两个片断分别克隆入克隆载体pGEX-4T-1和pUC19,酶切鉴定正确后,测序证实序列与GenBank中报告的完全一致,再分别克隆入原核表达载体pGEX-4T-1和pPRO-EXHT,测序正确,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE证实成功表达出了两个融合蛋白。将诱导表达后的大肠杆菌超声裂解后,分别取上清、沉淀和菌体做SDS-PAGE电泳,发现表达的蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在。随后用GSTrap FF亲和层析柱和Ni2+-NTA纯化柱分别纯化可溶性蛋白和包涵体形式的蛋白,并测定得到蛋白的浓度,Rv1884c蛋白的浓度为116.27μg.ml-1,Rv0867c蛋白的浓度为374.76μg.ml-1,保存于-20℃备用。2、Rv1884c和Rv0867c蛋白促生长作用的研究分别培养藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv,制成适当浓度的菌悬液,然后分别加入五种不同浓度（0pM、0.1pM、1pM、10pM、100pM）的两种蛋白,置37℃,取不同时间点的菌悬液测定OD600值,并分别绘制生长曲线。结果显示,重组Rv1884c和Rv0867c蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv都有不同程度的促进生长作用,经上述重组蛋白作用后菌悬液的吸光度值OD600都高于对照组菌悬液约0.41.3;两种蛋白对BCG和结核分枝杆菌H37Rv的促生长作用比对藤黄微球菌的作用明显;在相同条件下Rv0867c蛋白的促生长作用总体强于Rv1884c蛋白。本研究成功克隆了结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c基因片断,并在大肠杆菌中得到高效表达,获得了具有生物学活性的重组Rv1884c和Rv0867c蛋白;进一步研究证实这两种蛋白对藤黄微球菌、BCG和结核分枝杆菌H37Rv均具有一定的促生长作用,在相同条件下Rv0867c蛋白的促生长作用明显强于Rv1884c蛋白。这为研究结核分枝杆菌Rv1884c和Rv0867c的生物功能及其生长效应等奠定了基础。