研究背景:　　近年来，超声造影和无创靶向治疗技术发展突飞猛进，各种可携带药物或基因的超声微泡造影剂不断研制成功，超声介导微泡造影剂携带药物和基因靶向治疗技术在医学领域的应用日益广泛，该技术具有高效、靶向性强的优点，可降低治疗成本和副作用，且不影响药物的活性。载药微泡是指将有治疗作用的药物，以黏附、镶嵌或者非共价键结合的方式与微泡结合，既可减少该药物在血液中与其他药物的相互作用，减少毒副反应，又可减少其被酶催化的可能性，从而提高药效。人尿激肽原酶是近年研制的国家I类新药，可通过建立侧枝循环、促进神经修复的双重机制来提高急性脑梗死后脑的储备能力。现有证据表明，人尿激肽原酶能减少急性缺血性脑卒中后神经功能缺损，改善长期预后。本实验创新性地选择激肽原酶作为微泡造影剂的载药对象，将载药微泡经大鼠尾静脉注入体内后，在超声的介导下靶向治疗大鼠急性脑梗死，观察其对神经干细胞活化和血管新生的影响。　　第一部分、激肽原酶载药微泡的制备　　目的:　　探讨机械振荡法制备激肽原酶载药微泡的最佳参数，为超声介导微泡造影剂携带药物靶向治疗急性脑梗死的临床应用打下基础。　　材料与方法:　　1、激肽原酶载药微泡的制备　　1)一支声诺维用5ml生理盐水溶解，用力振摇20s直至瓶中内容物混合均匀，成乳白色混悬液。一支激肽原酶（单位0.15PNA）用20ml生理盐水溶解。　　2)根据微泡与激肽原酶混合的体积比，分为4组，分别为2：1组，1：1组，1：2组，1：4组，各组分别按比例取适量分装于西林瓶中避光密封保存备用。　　3)机械振荡仪由胶囊式调和器改装而成，水平往复式振荡，工作频率≥4500次/min，振动幅度:(15±1) mm。把分装好的激肽原酶和脂质微泡混合液置于机械振荡仪，分别采用不同的振荡时间（15s，30s、45s、60s、90s）振荡。振荡完成后，分别取微量混合液滴于载玻片上，抗荧光淬灭剂封片。　　2、吸光光度法检测A405nm值并计算载药微泡中激肽原酶的效价。　　3、流式细胞仪分析激肽原酶的携带率及稳定性；马尔文表面电位测量仪检测微泡的表面电位，激光粒度仪测量微泡粒径，以及粒径分布；PH计测量微泡的PH值；反向高效液相色谱仪测量并计算包封率。　　4、统计学分析应用SPSS17.0软件进行分析，计量资料以均值±标准差表示，符合正态分布的两组间比较用t检验，P<0.05表示差异具有显著性。　　结果:　　1、激肽原酶、微泡混合比为4:1时，激肽原酶效价最高，为(109.3±0.3)％，且达到合格标准（检测值在90%-115%之间为合格）。　　2、载药微泡的振荡时间与携带率45s振荡时间下激肽原酶的携带率最高，为（93.46±1.7）%，其次是60s（93.28±0.50）%和90s（92.21±1.7）%，15s振荡时间下药物携带率最低（58.9±7.83）%，且差异具有显著性（P<0.05)。　　3、微泡的粒径、表面电位、pH值及包封率空白微泡的粒径为8.1μm（8.1μm，8.1μm），分布稳定，载药微泡的粒径为10.54μm（5.66μm，25.17μm）；空白微泡表面电位为（-28.76±3.15）mV，载药微泡的表面电位为（-56.47±8.23） mV；载药微泡的PH值与空白微泡的PH值无明显改变（P>0.05）；载药微泡激肽原酶的包封率为（52.5±0.8)%。　　结论:　　1、当激肽原酶、微泡混合比为4:1时，采用机械振荡法可成功制备激肽原酶载药微泡，该载药微泡药物携带率高，稳定性较好。　　2、激肽原酶载药微泡能维持良好的药物效价，有望进一步应用于超声靶向治疗急性脑梗死。　　第二部分、超声介导微泡携带激肽原酶靶向治疗大鼠急性脑梗死　　目的:　　探讨超声介导微泡携带激肽原酶靶向治疗对大鼠急性脑梗死后神经及血管再生的影响。　　材料与方法:　　1、实验动物大脑中动脉闭塞（MCAO）模型的建立及实验分组：健康雄性SPF级wistar大鼠120只，体质量230-280g，适应性喂养1周后，线栓法建立大鼠MCAO模型。　　实验分组（每组24只）：　　1)超声介导激肽原酶微泡组：接受超声辐照及载药微泡尾静脉注射；　　2)超声介导空白微泡对照组：接受超声辐照及空白微泡尾静脉注射；　　3)超声辐照对照组：仅接受超声辐照；　　4)激肽原酶对照组：仅接受激肽原酶尾静脉注射；　　5)空白溶剂对照组：仅接受生理盐水尾静脉注射；　　2、超声辐照参数和辐照部位：超声探头直径1.5cm，超声频率2MHz，深度55mm，脉冲超声，辐照部位为缺血侧颅骨。　　3、给药方式：MCAO术后24h每组经尾静脉分别注射注射载药微泡、空白微泡、生理盐水、激肽原酶、生理盐水，每天1次，连用6d。前三组尾静脉注射的同时给予超声辐照15min。所有大鼠MCAO术后24h起每天2次经腹腔注射5-溴脱氧嘧啶核苷（BrdU50mg/kg，Sigma），连续6d，用以标记新增殖细胞。　　4、氯化三苯四唑(TTC)染色评估梗死灶体积：从不同时点的5组MCAO大鼠中各取6只，断头取脑并行冠状位切片，然后置于TTC溶液中37℃染色30分钟，梗死组织染成白色。　　5、神经功能评分：MCAO术后3d和7d，每组随机选6只大鼠，由不知道实验分组的研究人员用Bederson评分标准进行神经功能评价。　　6、灌注、取材及制片：将评分后的大鼠麻醉后，经灌注固定后取脑，再依次置于梯度蔗糖多聚甲醛磷酸盐缓冲液中，然后制备30μm冰冻切片。　　7、Laminin和DCX检测：冰冻切片采用免疫荧光法检测Laminin和DCX的阳性表达，荧光显微镜下观察和采集图像，并进行统计分析。　　8、统计学分析：应用SPSS17.0软件进行分析，数据用平均值±标准差表示，计量资料多组数据间比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD检验；等级资料采用Mann-Whitney U非参数检验。P<0.05有统计学意义。　　结果:　　1、脑梗死体积的比较：MCAO术后7d超声介导激肽原酶微泡组、超声介导空白微泡对照组，超声辐照对照组，激肽原酶对照组，空白溶剂对照组大鼠的脑梗死体积百分比分别为：(35.6±1.9)%，(37.4±1.0)%，(37.4±1.5)%，(36.0±2.0)%，(37.7±1.9)%，各组差异无统计学意义。　　2、术后第7天梗死侧DCX的阳性表达：超声介导激肽原酶微泡组、超声介导空白微泡对照组，超声辐照对照组，激肽原酶对照组，空白溶剂对照组SVZ区DCX阳性表达数量分别为：251.8±13.1、125.7±11.6、130.2±13.7、234.5±12.4和123.7±10.0。其中，超声介导激肽原酶微泡组和激肽原酶组梗死侧SVZ区DCX阳性表达的细胞数明显高于同时点超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、空白溶剂对照组（P<0.05）；另外，超声介导激肽原酶微泡组与激肽原酶对照组相比，梗死侧SVZ区DCX阳性表达的细胞数更高，差异有统计学意义(P<0.05)。　　3、术后第7天梗死侧Laminin的阳性表达：超声介导激肽原酶微泡组，超声介导空白微泡对照组，超声辐照对照组，激肽原酶对照组及空白溶剂对照组梗死灶周围血管密度分别为：10.0±0.8%、5.2±0.7%、5.0±1.0%、8.0±1.8%和5.0±0.9%。其中，超声介导激肽原酶微泡组和激肽原酶组梗死侧Laminin阳性表达的细胞数明显高于同时点超声介导空白微泡对照组、超声辐照对照组、空白溶剂对照组（P<0.05）；同时，超声介导激肽原酶微泡组与激肽原酶对照组相比，梗死灶周围血管密度更高，差异有统计学意义(P<0.05)。　　4、MCAO术后7d的神经功能评分为：1(0.75,1.25) vs2(2,3) vs2(1,2) vs1.5(0.75,2) vs2(2,2.5)，超声介导激肽原酶微泡组与其它四组相比，差异有统计学意义(P<0.05)。　　结论:　　1、超声介导激肽原酶载药微泡治疗较单用激肽原酶治疗更能促进大鼠 MCAO术后神经和血管的再生，进一步改善大鼠急性脑梗死后的神经功能。　　2、超声介导载药微泡靶向治疗技术可增强药效、靶向性强，且不影响药物活性，有望进一步应用于治疗神经系统疾病。