背景及目的:业已证明,糖尿病肾病的发生发展与过量脂质在肾实质的积聚密切相关。而研究也证实细胞内胆固醇无论是外源性摄入还是内源性合成,均通过一个依赖于胞内胆固醇水平的反馈调节系统来维持胆固醇的内稳态平衡。我们课题组前期研究表明:SCAP-SREBPs-LDLr/HMGCoA还原酶蛋白之间的相互作用可调节细胞内胆固醇稳态平衡;炎症状态下,固醇调节元件结合蛋白裂解激活蛋白(SCAP)运载固醇调节元件结合蛋白(SREBP)从内质网到达高尔基体,进而SREBP在高尔基体内水解剪切,释放其活性氨基端片段入核,与固醇调节元件(SRE)结合,增强靶基因的转录,使LDL受体(LDLr)和HMGCoA还原酶(HMGCoAR)表达增加,导致胆固醇摄取和合成增多。糖基化终产物及炎症因子是糖尿病肾病的主要致病因素,然而它们的致病机制尚未完全阐明,是否可通过引起细胞内胆固醇异常积聚而介导糖尿病肾病发生发展值得研究。本实验为证实糖尿病状态下过度产生的糖基化终产物(CML)及炎症因子(1L-1β)是否通过上调SCAP表达及参与SCAP的高尔基体蛋白糖基化修饰,导致SCAP的异常分布,最终引起脂质在肾系膜细胞(HMCs)积聚。　　 方法:　　 1.根据不同研究目的,将人肾系膜细(HMCs)与糖基化终产物(CML,50μg/ml)、低密度脂蛋白(LDL,200μg/ml)、CML+LDL、CML+高尔基酶抑制剂(Kifunensine,2.5μg/ml+Swainsonine,5μg/ml)、CML+LDL+高尔基酶抑制剂和炎症因子(IL-1β,20 ng/ml)、IL-1β+LDL、IL-1β+高尔基酶抑制剂、IL-1β+LDL+高尔基酶抑制剂共孵育24小时。　　 2.油红染色检测细胞内脂质沉积情况。　　 3.酶学方法检测HMCs身细胞内总胆固醇(TC),游离胆固醇(FC)和胆固醇酯(CE)的水平。　　 4.提取细胞总RNA,应用实时定量RT-PCR技术分别检测细胞LDLr、HMGCoAR、SREBP-2、SCAP和α甘露糖苷酶Ⅰ和α甘露糖苷酶Ⅱ mRNA的表达。　　 5.用Westernblotting检测LDLr、HMGCoAR、SREBP-2和SCAP蛋白表达水平。　　 6.用密度梯度离心的方法分离细胞高尔基体,用酶学方法检测高尔基体酶(α甘露糖苷酶Ⅰ和α甘露糖苷酶Ⅱ)活性。　　 7.用放线菌酮素(CHX)处理HMCs观察SCAP蛋白半衰期的变化。　　 8.用转染pEGFP-SCAP的HMCs和抗高尔基抗体染色后,应用激光共聚焦显微镜观察细胞SCAP-SREBP复合物存内质网和高尔基体的定位。　　 结果:　　 1、在无脂或高脂状态(LDL)下,与各自对照组相比,CML和IL-1β干预组HMCs胆固醇积聚显著增加,且细胞内TC、FC和CE水平明显高于对照组。　　 2、生理状态下,与对照组(设置为1)相比,LDL干预组HMCs LDLr和HMGCoAR基因(0.168±0.041和0.056±0.0166)、蛋白(0.185±0.058和0.403±0.085)水平显著减低,CML干预组HMCs LDLr和HMGCoAR基因(1.197±0.115和1.357±0.231)及蛋白(1.647±0.257和1.347±0.159)表达显著增加,IL-1β干预组HMCs LDLr和HMGCoAR基因(1.338±0.171和1.256±0.122)及蛋白(1.437±0.153和1.257±0.128)表达显著增加;在高脂状态下,与单纯LDL干预组相比,CML干预组HMCs LDLr和HMGCoAR基因(0.275±0.064和0.180±0.054)及蛋白1(1.017±0.282和0.597±0.116)表达显著增加,IL-1β干预组HMCs LDLr和HMGCoAR基因(0.272±0.012和0.066±0.031)及蛋白(0.974±0.054和0.960±0.075)表达显著增加。　　 3、进一步探讨CML及IL-1β对LDLr/HMGCoAR的上游调控蛋白——核转录因子SREBP-2和胆固醇敏感器SCAP的影响。与对照组(设置为1)相比,LDL干预组HMCs SREBP-2和SCAP的基因(0.794±0.066和0.489±0.126)、蛋白(0.594±0.066和0.889±0.232)表达显著减低,同时HMCs SCAP-SREBP复合物从内质网向高尔基体的转移显著减少;CML干预组HMCsSREBP-2和SCAP基因(2.062±0.420和2.419±0.366)、蛋白(1.595±0.171和1.919±0.468)表达明显增加,IL-1β干预组HMCs SREBP-2和SCAP基因(2.228±0.658和1.531±0.194)、蛋白(1.620±0.124和1.648±0.086)表达明显增加,同时CML或IL-1β均致HMCs SCAP-SREBP复合物从内质网向高尔基体的转移显著增多;在高脂状态下,与单纯LDL干预组相比,CML干预组 HMCs SREBP-2和SCAP的基因(1.077±0.152和0.805±0.242)及蛋白(0.895±0.108和1.105±0.224)表达显著增加,IL-1β干预组 HMCsSREBP-2和SCAP的基因(1.123±0.205和0.724±0.160)及蛋白(1.240±0.099和1.003±0.072)表达显著增加,同时HMCs SCAP-SREBP复合物从内质网向高尔基体转移明显增多。　　 4、探讨CML及IL-1β对SCAP糖基化修饰酶——高尔基体酶(α甘露糖苷酶Ⅰ和α甘露糖苷酶Ⅱ)的影响。在无脂状态下,与对照组(设置为1)相比,CML干预组HMCs高尔基体酶(α甘露糖苷酶Ⅰ和α甘露糖苷酶Ⅱ)基因达(1.998±0.334和1.833±0.231)及活性(1.386±0.063)显著增加,IL-1β干预组HMCsα甘露糖苷酶Ⅰ和α甘露糖苷酶Ⅱ基因表达(1.966±0.649和2.553±0.211)及活性(1.256±0.088)显著增加;在高脂状态下,与单纯LDL干预组相比,CML干预组HMCsα甘露糖苷酶Ⅰ和α甘露糖苷酶Ⅱ基因表达(1.329±0.185和1.145±0.073)及活性(1.151±0.048)显著增加,IL-1β干预组HMCsα甘露糖苷酶Ⅰ和α甘露糖苷酶Ⅱ基因表达(1.775±0.295和1.171±0.097)及活性(1.133±0.065)显著增加。　　 5、常规培养下,HRMc SCAP的蛋白剩余水平随时间延长越来越少(2h:0.856±0.103,4h:0.665±0.104,8h:0.525±0.097,24h:0.434±0.054,48h:0.248±0.044);而CML和IL-1β共孵育纽SCAP的蛋白剩余水平明显高于各时间点相应对照组(2h:0.929±0.165和0.855±0.123,4h:0.761±0.106和0.891±0.141,8h:0.774±0.077和0.840±0.099,24h:0.668±0.073和0.798±0.102,48h:0.550±0.067和0.677±0.082)。　　 6、在无脂状态下,高尔基体酶抑制剂干预组LDLr(基因:0.741±0.157,0.747±0.126;蛋白:0.808±0.088,0.778±0.093)、HMGCoAR(基因:0.629±0.102,0.837±0.049;蛋白:0.842±0.087,0.781±0.033)和SREBP-2(基因:0.649±0.068,0.795±0.059;蛋白:0.792±0.088,0.883±0.041)均明显低于CML及IL-1β干预纽;在高脂状态下,高尔基体酶抑制剂干预组LDLr(基因:0.705±0.049,0.640±0.017;蛋白:0.806±0.100,0.853±0.047)、HMGCoAR(基因:0.454±0.166,0.802±0.047;蛋白:0.867±0.056,0.873±0.057)和SREBP-2(基因:0.307±0.081,0.857±0.062;蛋白:0.870±0.033,0.840±0.081)均明显低于CML及IL-1β对干预组。　　 结论:　　 1、CML或IL-1β能明显增加HIMCs TC、FC和CE水平,促进细胞内胆固醇积聚。　　 2、正常生理状态下,LDL可以反馈抑制HMCs的LDLr和HMGCoAR基因及蛋白表达,CML或IL-1β可上调LDLr和HMGCoAR表达,同时CML或IL-1β能干扰LDL对LDLr和HMGCoAR表达的下调作用。　　 3、正常生理状态下,LDL可以反馈抑制HMCs LDLr/HMGCoAR上游调控蛋白—SREBP-2和SCAP基因及蛋白表达,并抑制SCAP-SREBP复合物从内质网向高尔基体转移,CML或IL-1β可上调SREBP-2和SCAP表达,同时CML或TL-1β能干扰LDL对SREBP-2和SCAP表达的下调作用,并促进SCAP-SREBP复合物从内质网向高尔基体转移,致SCAP从内质网异常逃逸。　　 4、在无脂或高脂状态下,CML或IL-1β均可增强细胞内高尔基体酶(α甘露糖甙酶Ⅰ、GlcNaC转移酶Ⅰ和α甘露糖苷酶Ⅱ等)基因表达及其活性,增加SCAP蛋白剩余水平,提示CML或IL-1β可通过增加高尔基体酶的表达和活性,加速SCAP的N端糖链的转录后修饰,延长SCAP的半衰期,致SCAP在内质网和高尔基体间异常循环。　　 5、在无脂或高脂状态下,高尔基体酶抑制剂可抑制CML或IL-1β对上述脂质调节元件的上调作用。　　 糖尿病状态下,过度生成的糖基化终产物和炎症状态可打破SCAP的正常生理功能,引起SCAP异常逃逸和异常循环,致大量SREBP2运载至高尔基体进行酶切,激活入核,使LDL受体和HMGCoA还原酶表达增加,导致HMCs脂质积聚,引起糖尿病性肾小球硬化,最终发展为糖尿病肾病。