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mRNA及蛋白质表达定量技术和真核表达技术是研究牛小肽吸收营养生理意义及bPepTI转运特性的必要技术手段。本研究采用Real Time PCR相对和绝对定量方法测定了牛消化道各段bPepTI基因mRNA的表达量;构建了bPepTI蛋白的原核表达系统表达bPepTI蛋白,为建立牛消化道bPepTI蛋白表达的免疫荧光定量技术奠定了基础;构建了bPepTI基因的真核表达载体,为构建bPepTI真核表达系统提供了前端关键技术。1、牛消化道各段I型肽载体(bPepTI)mRNA表达的定量研究试验采用RT-PCR相对定量方法检测利木赞×鲁西黄牛杂交牛消化道各部位及渤海黑牛、荷斯坦牛、鲁西黄牛和利木赞×鲁西黄牛杂交牛四个不同品种牛小肠PepTImRNA的表达差异。结果表明,牛各段消化道bPepTImRNA表达量由高到低的顺序依次为空肠、回肠、盲肠、十二指肠、瘤胃、结肠、皱胃、瓣胃、网胃,消化道各段表达差异不显著(P>0.05),消化道各段表达差异不显著(P>0.05);不同品种牛小肠PepTImRNA的表达:十二指肠组织,四个品种之间差异极显著(P<0.01),荷斯坦牛表达量最高,显著高于渤海黑牛(P<0.05),极显著高于鲁西黄牛和利木赞×鲁西黄牛杂交牛(P<0.01),鲁西黄牛与渤海黑牛、利木赞×鲁西黄牛杂交牛差异不显著(P>0.05),渤海黑牛显著高于利木赞×鲁西黄牛杂交牛(P<0.05);空肠组织,品种之间差异极显著(P<0.01),鲁西黄牛表达量最高,与渤海黑牛、荷斯坦牛和利木赞×鲁西黄牛杂交牛差异显著(P<0.05),渤海黑牛和利木赞×鲁西黄牛差异不显著(P>0.05),与荷斯坦牛差异显著(P<0.05);回肠组织,品种之间表量差异极显著(P<0.01),荷尔斯坦牛表达量最高,显著高于渤海黑牛、鲁西黄牛和利木赞×鲁西黄牛杂交牛(P<0.05),鲁西黄牛和利木赞×鲁西黄牛杂交牛差异不显著(P>0.05)。绝对定量法检测利木赞×鲁西黄牛杂交牛消化道各部位PepTImRNA表达量。结果显示,表达量由高到低依次为:空肠、瓣胃、网胃、瘤胃、盲肠、十二指肠、回肠、皱胃、结肠,总体差异极显著((P<0.01)。在胃部组织中,瓣胃bPepTI表达量最高,与网胃差异不显著(P>0.05),但极显著高于瘤胃和皱胃(P<0.01);网胃bPepTI的表达量与瘤胃和皱胃差异显著(P<0.05),瘤胃和皱胃之间差异不显著(P>0.05)。肠道组织中,空肠bPepTI的表达量最高,极显著高于十二指肠、回肠(P<0.01);十二指肠与盲肠、回肠不差异显著(P>0.05),十二指肠、回肠、盲肠显极著高于结肠(P<0.01)。空肠bPepTI的表达量显著高于瓣胃(P<0.05);瘤胃、十二指肠、回肠与盲肠之间差异不显著(P>0.05),十二指肠、回肠、盲肠与皱胃之间表达量差异不显著(P>0.05)。结合本试验及其它试验研究结果,bPepTImRNA的表达量,空肠最高,其次是瓣胃,大肠表达量最低。2、牛消化道I型肽载体(bPepTI)原核表达为通过原核表达获得纯化bPepTI蛋白,进而能够制备bPepTI蛋白抗体,建立消化道bPepTI蛋白表达量的荧光免疫定量方法,本试验通过优化PCR扩增条件克隆了bPepTI基因的完整编码区,分别与pET-32a和pGEX-6P-1载体连接,构建了原核表达载体并分析了bPepTI蛋白结构。通过优化IPTG浓度、诱导温度、诱导时间、感受态细胞等条件进行蛋白表达,在所优化的表达条件下,重组体在大肠杆菌表达系统中未表达到理想蛋白,经分析bPepTI含有8个糖基化位点,5个PKC和1个PKA磷酸化位点。3、牛消化道I型肽载体(bPepTI)真核表达载体的构建为构建bPepTI真核表达系统,进一步研究消化道小肽转运载体的动力学特性,试验通过优化PCR扩增条件克隆bPepTI基因的完整编码区,和真核表达载体pcDNA3.1/V5-his-B连接,构建真核表达载体。试验扩增了bPepTI完整编码区的正确序列,成功构建了pcDNA3.1/V5-his-B-bPepTI真核表达载体。