杀粉蝶菌素A1（Piericidin A1）是具有良好生物活性的-吡啶酮天然产物，可由多种链霉菌产生。它通过结合线粒体呼吸作用复合体I，抑制Fe-S簇氧化和泛醌的还原，从而作为线粒体呼吸作用抑制剂发挥作用。由于这一作用机理，杀粉蝶菌素A1对致病真菌显示较强的生物活性，但对微生物、植物致病菌抗菌活性相对较弱。此外，对蚕、菜青虫有很显著的杀虫效果。最近新的研究进展表明，杀粉蝶菌素A1还有抑制肿瘤的效果。上世纪七十年代，通过同位素前体的喂养发现碳骨架来自乙酸盐和丙酸盐单位，而与已知的其他-吡啶酮天然产物都是通过杂合PKS-NRPS合成显示出显著不同。本课题出发菌株是由浙江省农科院筛选的票霉素链霉菌杭州湾变种，是拥有我国自主知识产权的微生物资源。前期通过诱变育种得到的突变株，可产生具有较高杀虫活性的杀粉蝶菌素衍生物，但精确结构尚未确定。本研究首先对该菌株的次级代谢产物进行发酵和分离，并对活性成分进行结构鉴定，确定其结构为杀粉蝶菌素A1。此外，优化产生菌的产孢条件和接合转移条件，建立了遗传操作系统，为通过体内遗传学研究杀粉蝶菌素A1生物合成机理奠定了基础。通过Roche454高通量测序平台，对票霉素链霉菌杭州湾变种进行了基因组扫描，捕获了杀粉蝶菌素A1的生物合成基因簇。并对17kb区域进行大片段缺失，证实了与杀粉蝶菌素A1生物合成相关。进一步通过染色体步移和拼接（引物设计补gap），获得与杀粉蝶菌素A1的生物合成相关的长达130kb的序列。对这130kb的序列进行生物信息学分析，确定杀粉蝶菌素A1的生物合成途径包含12个基因，编码1个调控蛋白PieR、6个聚酮合酶PieA1-PieA6、1个转氨酶PieD、1个功能未知蛋白PieC、2个甲基转移酶PieB1和PieB2和1个单加氧酶PieE。以所包含的功能信息为依据，对这些蛋白功能进行了深入分析，推测杀粉蝶菌素A1的生物合成是由聚酮合酶、转氨酶和其它未知功能蛋白参与形成核心结构-吡啶环，由甲基转移酶和单加氧酶完成后修饰步骤，调控基因行使杀粉蝶菌素A1生物合成的特异性调控。随后，对参与杀粉蝶菌素A1核心结构-吡啶环生物合成的基因，pieTE、pieC和pieD基因进行了体内基因置换，并对获得的相应突变株进行了发酵检测。pieD、pieC、pieTE基因中断突变株发酵产物中都没有检测到中间产物的积累，一种原因可能是这类小分子的中间物没有特征的紫外吸收，很难检测；另外一种可能是这类中间物在体内复杂环境中被降解了。通过组合多种体外生物化学分析方法，研究了PieA6中的module8-TE的作用，确定了PieTE的水解功能。首先表达了重组蛋白module8-TE及点突变株module8-TE0（S148A），加入β-ketoacyl-SNAC和malonyl-CoA，经过一轮PKS的延伸缩合，产生β,-diketoacyl-S-ACP8。通过检测到的β,-diketo carboxylic acid脱羧后产生的undecane-2,4-dione，及fluoresceinamine偶联实验中产生的新峰对应于3,5-dioxododecanoicacid的偶联产物，证明PieTE是负责水解释放β,-diketoacyl-S-ACP8成线性β,-diketo carboxylic acid。此外，用DTNB试剂检测了PieTE水解SNAC模拟底物的水解能力，证实PieTE结构域可以水解β-ketoacyl-SNAC，并且对长碳链的底物具有偏好性，对短链的模拟底物基本无水解活性。当定点突变失活PieTE，使用module8-TE0（S148A）进行同样的体外催化反应时，发现天然底物β,-diketoacyl-S-ACP8很容易自发环化形成-吡喃酮。基于上述体内基因置换及体外模拟底物生物化学分析，发现了一种新的-吡啶环生物合成途径并初步阐明了杀粉蝶菌素A1的生物合成途径。I型PKS模块以典型的流水线装配模式组装成聚酮骨架，并被PKS C-端的PieTE直接水解释放生成线性聚酮链，PieD以游离氨为氨基供体，对聚酮链末端的羧基转氨，进而可能由PieC参与环化反应，形成核心结构-吡啶环。实验结果表明，由于PieTE可以高效地直接水解释放线状聚酮酸，所以避免了β,-diketoacyl-S-ACP8自发环化成-吡喃酮。与已报道的其他-吡啶酮类天然产物通过PKS-NRPS途径加载氨基酸单元而引入氮原子不同，证实杀粉蝶菌素A1的生物合成中具有一个新的-吡啶环合成途径。在杀粉蝶菌素A1的生物合成过程中，不是由氨基酸提供-吡啶酮上的氨基供体，而且需要PieTE高效催化水解将不稳定的β,-diketoacyl-S-ACP8释放，进一步以游离氮为氨基供体进行转氨环化，形成-吡啶酮。通过体内基因置换，失活了生物合成基因簇中的三个修饰基因pieB1、pieB2和pieE。初步分析鉴定了突变株积累的中间物，已成功的对pieB2的目标中间物通过大规模发酵，积累了5mg纯品，准备进行NMR结构鉴定；构建了在大肠杆菌中异源表达PieB1、PieB2、PieE重组蛋白的表达载体。这部分实验初步阐述了杀粉蝶菌素A1生物合成途径中形成-吡啶酮核心结构后，三步修饰过程发生的先后顺序，为进一步研究这三个后修饰基因功能奠定了基础。此外，利用生物信息学工具，深入分析基因组序列，发现该菌株还包含丰富的其他多种次级代谢产物的生物合成信息，如PKS、NRPS、杂合NRPS-PKS、aminoglycoside、terpene、siderophore、lantibiotic等，为后期挖掘该菌株丰富的次级代谢产物资源提供基因序列的支持。