腺病毒CNHK200-hEndostatin的质量控制及其大规模扩增、纯化的初步研究

来源 :第二军医大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:yan4321
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基因治疗是作为遗传病的一种治疗手段而开始被人们所熟知,但是,随着基因治疗技术的不断进步,它在肿瘤治疗、心血管疾病治疗方面也正越来越受到人们的关注。基因治疗的基本原理是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用,从而达到治疗疾病的目的。目前应用最多的是用病毒载体将基因导入的方式,其中腺病毒是最常用的载体。它的优点有:(1)宿主范围广,对人致病性低;(2)与人类基因同源;(3)能同时表达多个基因;(4)无需辅助病毒,可容纳几kb到几十kb的外源DNA;(5)在增殖和非增殖细胞中均能感染并表达基因;(6)不整合到染色体中,无插入致突变性;(7)易于扩增和纯化,可获得高滴度病毒。内皮抑素是一种被认为最有效的肿瘤新生血管抑制因子之一,具有高效抑制肿瘤新生血管的形成,从而抑制肿瘤的生长和转移,即使数百倍剂量在人体中也无毒副作用及反复应用也无耐药性等优点。然而使用内皮抑素蛋白质进行治疗,需要量极多(50mg/kg/天),同时需要每天给予治疗,价格极为昂贵。为此,我们构建了一种能肿瘤细胞内特异性复制且高效表达人内皮抑素的基因-病毒载体系统,利用病毒在肿瘤细胞内特异性增殖及复制,从而高效表达人内皮抑素。这一系统在实验研究中被证实对肿瘤的生长具有显著的抑制作用,具有很好的临床应用前景。目前腺病毒研究主要集中于载体的研究方面,而关于其扩增、纯化以及质量控制方面的研究却是非常少见,尤其国内在这一方面更是难以找到相关文献。如何获得大量稳定的GMP质量的腺病毒以及如何进行质量控制已成为限制腺病毒应用于临床的一个重要问题。我们应用高效表达人内皮抑素的基因-病毒载体系统CNHK200-hEndostatin,对腺病毒的质量控制、大规模扩增和纯化进行研究,为其将来应用于临床打下基础。腺病毒的质量控制方法,主要依照《人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》、《中国生物制品规程》、《中国药典》和《药品生产质量管理规范》等要求,同时参考世界卫生组织(WHO)和美国食品药品管理局(FDA)颁布的指南、国际医药法规协调会议(ICH)文件等,着重对腺病毒的鉴定、表达基因鉴定、野生型腺病毒检测、腺病毒定量、纯度检测以及杂质检测等方面进行方法的建立和考察。腺病毒产品的质量控制包括好几个层面,除了对最终产品要进行严格的质量检测之外,更要对生产过程以及生产过程中涉及到的生物制品进行质量控制,尤其需要对用于生产的病毒库和细胞库进行监测。因此,腺病毒的质量控制是一个复杂而重要的工作,是腺病毒能够进行大规模扩增、纯化和最终质量的保证。由于细胞的质量控制方法在以往的生物制品生产研究中已经趋于成熟,所以本课题中讨论的是对腺病毒本身进行质量控制所需要的方法的建立。重组腺病毒产品CNHK200-hEndo是由载体DNA即腺病毒DNA和治疗基因即人内皮抑素基因所构成,其基本质量指标包括鉴别实验和效力实验,是从腺病毒产品的鉴定、治疗基因的存在、表达和生物学活性四个方面进行检测。鉴别实验包括限制性内切酶图谱分析和治疗基因的PCR鉴定,效力实验包括基因表达检测和生物学活性检测,是进一步验证存在于产品中的目的基因经腺病毒载体介导后是否可在靶细胞中表达目的蛋白以及表达的目的蛋白是否具有生物学活性。在本研究中,我们用SDS-PAGE方法对腺病毒进行蛋白鉴定,用限制性内切酶图谱分析的方法对腺病毒进行DNA鉴定,结果表明样品均符合目的腺病毒的要求。同时,应用PCR的方法来鉴定内皮抑素基因是否存在于该腺病毒DNA中,对于其表达情况和生物活性则使用ELISA的方法,结果表明该基因存在于该腺病毒DNA中并在细胞中能够成功表达,具有生物活性。应用上述方法进行腺病毒鉴定,我们的实验显示结果稳定,而且可重复性强,操作简便,是行之有效的鉴别方法。病毒的颗粒数、活性感染单位和比活性、纯度是体现腺病毒产品有效性和一致性的核心指标。目前,FDA和SFDA都推荐用病毒颗粒数而不是病毒滴度来对腺病毒进行定量,临床应用也以颗粒数作为病毒量的标识,同时通过对比活性的限制来保证腺病毒产品的活性质量。传统的病毒颗粒数检测仍然存在技术上的缺陷,传统的方法是通过检测病毒基因组DNA的光吸收值来计算的,该方法要求病毒有较高的浓度,并且纯度也要非常高,否则计算出来的结果是不准确的,而且,这种方法也没有办法区分感染性和缺陷性病毒颗粒。我们建立了用阴离子交换层析方法检测病毒颗粒数的方法,不仅对于样品量的要求低,而且即使样品中混有蛋白和DNA杂质也能得到有效的区分,使病毒颗粒数的计算更为准确和稳定。虽然这种方法仍需要进一步严格的方法验证,但用此方法来取代传统方法应该是具有很大可行性的。病毒感染性活性的检测是用生物学的方法,其结果受到许多可变因素的影响,因而往往稳定性和重复性都较差,这些方法包括:报告基因测定法、病毒空斑测定法以及TCID50测定法。目前应用最多的是TCID50测定法,这种方法检测速度较快,结果更具预料性,在不同操作个体间也更稳定。我们采用每个样品由2名技术人员分别测定2次,取其平均值作为最终结果,这样的处理方法使得我们的腺病毒滴度测定结果更为稳定。腺病毒的纯度检测,目前国内外常用的方法主要有OD260/OD280比值分析、HPLC分析和SDS—PAGE电泳法。OD260/OD280测定法比较简单,属于相对定量,受残余细胞蛋白质和DNA的影响导致结果偏差,且易受操作因素影响。SDS—PAGE电泳法是以检测病毒蛋白质纯度为依据的一种检测方法,操作的影响因素多,比较适合实验室研究,当蛋白量微或杂质蛋白表现与病毒蛋白相似行为时易导致结果偏差。高效液相色谱分析法是利用离子交换层析的原理进行纯度分析,检测过程为全自动化程序控制,基本排除人为因素的干扰,操作简便,完成每份样品的测定仅需30min甚至更短,能够快速、准确地对产品生产全过程的重组腺病毒产率进行在线检测,实现规模化生产的质量控制。我们采用建立的HPLC方法对纯化的腺病毒CNHK200-hEndo进行纯度检测,结果达到99%,完全达到临床应用的要求。我们用PCR方法对野生型腺病毒进行检测,扩增腺病毒CNHK200-hEndo中部分缺失而野生型腺病毒中仍然保存的E1B区。结果表明,这种方法完全可以用于检测野生型腺病毒基因组的存在,而进行检测的腺病毒产品CNHK200-hEndo并未检测到野生型腺病毒。残余宿主DNA含量和残余牛血清蛋白含量是腺病毒杂质检测中重要的两项,对于未来临床应用的安全性具有重要意义。在本研究中应用地高辛标记的探针对腺病毒样品进行线杂交,其检测敏感度高,可以检测到1pg/ml的DNA含量,但是易出现假阴性和假阳性,仍需要进一步进行优化和调整。残余牛血清蛋白含量测定是应用中国药品生物制品检定所提供的常规检测试剂和方法,方法简单,易于掌握,结果稳定,可用于腺病毒的质量控制。其它腺病毒质量控制的方面包括PH、内毒素含量、无菌试验、异常毒性试验等都是普通生物制品的常规质量控制项目,具有成熟的试剂、设备和方法,因此未作重点讨论。本研究根据国际和我国的相关生物制品和基因治疗的法规、标准以及参考文献,初步建立了适用于腺病毒CNHK200-hEndo的整套质量控制方法。目前,用于腺病毒生产的包装细胞有293、911和PER.C6细胞,最为常用的还是293细胞,使用这一细胞虽然有产生野生型腺病毒的危险,但可以获得很高的病毒滴度。我们采用含10%胎牛血清的DMEM培养基作为293细胞的生长培养基。由于胎牛血清中含有可以灭活腺病毒的成分,因此一般在扩增病毒的时候要采用血清含量较少的培养基。同时,由于没有血清成分的支持会对细胞生长产生不良影响,从而减少病毒产量,所以又必须保留一定浓度的血清成分。我们参考国内外文献以及结合自己的实践经验,将生产腺病毒的培养基定为含2%胎牛血清的DMEM培养基。在应用反应器进行腺病毒扩增的过程中,由于细胞生长的情况将直接决定病毒的产量,因此,细胞培养载体的选择也是十分重要的。293细胞的特点是贴壁的能力较差,易脱落和结团,由于固定床式反应器采用灌注培养方式而不需要细胞截流系统,贴壁能力差的细胞也能在该系统中很好地培养。我们用此种方式培养293细胞,采用灌注培养,细胞接种后贴壁很快,接种1小时后细胞贴壁率可达98%以上。整个培养周期约7-10天,细胞增殖可达25-50倍。腺病毒的产量不仅取决于宿主细胞的数量和生长状况,其感染条件也是一个非常重要的因素。在感染条件中,病毒MOI(Multiplity Of Infection,感染量)是一个最重要的因素。从我们的实验来看,MOI为50以上时将显著影响病毒的产量,而如果低于5,则收获时间也会受到显著影响。我们在初步确定MOI感染范围的基础上,在反应器扩增腺病毒过程中应用5、10、15、20四个MOI值感染293细胞,结果发现在MOI=10的条件下病毒产量最高,而且病毒收获时间也比较合适。在灌注培养中,很重要的一个参数是灌注量的确定。由于病毒扩增是一个动态的过程,细胞在感染病毒后的一系列代谢变化将改变常规生长状态下对营养的需求量。我们通过检测培养液中葡萄糖的含量来跟踪细胞的代谢变化,并通过维持不同水平的葡萄糖含量来研究灌注量对于病毒扩增的影响。结果发现,当灌注量较低,维持较低水平葡萄糖浓度时,细胞生长缓慢,病毒扩增能力较低,所收获的病毒总量也较低;但是,如果灌注量太高,维持较高水平葡萄糖浓度时,细胞代谢加快,也不利于病毒的生长和扩增,总的病毒产量也并没有得到很大提高。只有在合适的灌注量情况下,维持合适的葡萄糖浓度才能得到较高产量的腺病毒。此外,我们通过实验确定了生物反应器扩增腺病毒所涉及的其它参数,如载体量、搅拌转速、感染时间、病毒上清的过滤孔径等,基本建立了腺病毒通过反应器扩增的方法。按照上述方法,我们扩增了三批CNHK200-hEndo腺病毒,结果总产量均达到1015vp以上,比活性也基本符合要求,能够满足临床试验的需要量。腺病毒的纯化,一直是用CsCl梯度超离心的方法。传统的用CsCl梯度超离心纯化病毒的方法已比较成熟,在实验室中被广泛使用,但该方法存在很大的局限性:一是批处理量小,回收率较低,仅有10-30%;二是一般需要经过多次超离心才能得到纯品,步骤繁琐;三是用超离心纯化的病毒活性不稳定,不易重复。随着临床实验的进展,对临床级腺病毒载体的需求迅速增加,为了满足基因治疗的需要,建立适用于大规模生产的纯化技术非常必要。离子交换色谱是色谱技术的一个分支,是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同,经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。该法可以同时分析多种离子化合物,具有灵敏度高,重复性、选择性好,分离速度快等优点,是当前最常用的层析法之一,常用于多种离子型生物分子的分离,包括蛋白质、氨基酸、多肽及核酸等。离子交换层析最常用的方法是让被纯化物质吸附在离子交换基团上,然后用持续的或离子强度逐渐升高的洗脱液将其从杂质中分离。我们首先选择了DEAE Sepharose F.F.、SOURCE 30 Q和Q Sepharose XL三种不同材质的阴离子交换层析的填料进行试验,通过采用相同的纯化参数,比较各填料在纯化腺病毒过程中的回收率以及最终腺病毒样品的纯度。结果发现,纯度结果最好的是SOURCE 30 Q,达到了85%;回收率最好的也是SOURCE 30 Q,达到了80%,因此使用SOURCE 30 Q作为进一步研究的介质。SOURCE 30Q为多孔的球型刚性颗粒,颗粒直径30μm,可以在PH2~12范围、4―40℃条件下工作,在一般亲水缓冲液中稳定。更重要的是,它能够耐受121℃、20min的高温灭菌,因此适用于对临床样品的制备。我们应用SOURCE 30Q对腺病毒进行纯化,建立了以下纯化参数:(1)填料体积为300ml;(2)平衡液为20mM Tris、150mM NaCl、2mM MgCl2、PH7.5,洗脱液为20mM Tris、1M NaCl、2mM MgCl2、PH7.5;(3)平衡和上样、洗脱流速均为10ml / min(4)洗脱程序为10个柱体积线性梯度洗脱。按照上述参数纯化经超滤浓缩和纯化的腺病毒样品,能够很好的分离腺病毒、蛋白杂质和核酸杂质,收集到的腺病毒峰中杂质含量极微,经HPLC分析腺病毒纯度可以达到99.7%,回收率也达到80%以上。同时,通过对反应器扩增的病毒上清的纯化过程,我们发现在300ml体积填料的情况下,其腺病毒载量可以达到2×1014vp,这样的载量已经基本能满足大规模制备腺病毒的需要。此外,腺病毒保存溶液的研究也是一个重要课题。病毒颗粒必须保持它们的结构完整性以保持它们的感染性和生物活性,病毒载体的结构完整性经常在制剂的过程中损坏,这妨碍了它作为基因治疗载体的用途。我们制订了三种腺病毒保存液配方,通过稳定性试验考察腺病毒在这些保存液中的稳定性。结果发现,腺病毒在4℃条件下也能较长期地保存,在配方A和配方C中腺病毒可以在6个月以内一直保持其数量和活性。总的来说,应用超滤的方法可以将病毒原液中的较小的蛋白分子和杂质初步去除,然后应用离子交换层析的方法纯化腺病毒能够满足大规模纯化病毒的要求,其纯化质量和产量都比较稳定,扩大后可以应用于临床腺病毒制品的生产。
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