研究背景： 抗体药物是当前药物研发的重点领域。作为一种重组蛋白,抗体药物在生产、运输、储存以及体内使用过程中,容易发生多种降解;其中脱酰胺和异构化作用是两种最常见的化学降解方式,影响抗体稳定性、生物学活性及生物利用度。提高抗体药物稳定性对抗体成药性至关重要。除提高稳定性外,优化抗体效应功能也是增强抗体临床疗效的一个重要研究方向。治疗性抗体虽然具有很强的靶向性,但是单独用药的治疗效果有限,尤其是对于实体瘤的治疗。细胞毒性药物虽然对癌细胞具备很强的杀伤效力,但是缺乏靶向性,常常误伤正常细胞,从而引起严重的毒副作用。抗体-小分子药物偶联物(ADC)利用抗体作为载体将细胞毒性药物送至靶部位,并通过细胞内吞效应进入溶酶体,释放出细胞毒性药物,从而达到专一性杀死癌细胞而不损伤正常组织细胞的作用。将抗体高特异性和细胞毒性药物高毒性有机结合的ADC药物成为提高抗体效应功能的一个重要发展方向。Genentech公司的单抗药物Herceptin是美国FDA批准上市的第一个乳腺癌靶向治疗的抗体药物,2014年全球销售额达68亿美元。该药物由于稳定性等因素选择了冻干制剂。研究显示,Herceptin抗体可变区潜在的脱酰胺效应、异构化效应是影响其稳定性的主要因素之一。研究目的 本研究的目的是在保持抗体Herceptin生物学活性的基础上提高其稳定性,优化、筛选新的靶向HER2候选抗体;在此基础上,进一步构建抗体-小分子药物偶联物,比较不同抗体、小分子药物以及偶联方式对ADC活性的影响,为进一步的ADC药物开发奠定基础。研究方法 借助计算机分子模拟及合理设计技术分析、确定Herceptin抗体可变区脱酰胺和异构化热点及优化突变策略;利用基因定点突变技术突变Herceptin(T-m Ab1)抗体可变区两个脱酰胺和异构化的降解热点LC-CDR1-Asn30、HC-CDR3-Asp102;通过真核表达、亲和纯化获得突变体T-m Ab2;经质谱、肽图对突变位点进行鉴定后,利用液相、CE-SDS、ic IEF等对T-m Ab2的理化性质进行全面分析,通过SEC、IEC、肽图质谱等方法比对研究T-m Ab2与母本抗体T-m Ab1在不同p H条件下的长期、加速及高温稳定性;利用FACS、ELISA、体外细胞实验及体内抑瘤实验对抗体T-m Ab2的生物学活性进行评价。进一步通过体外结合活性实验及细胞杀伤实验对T-m Ab1、T-m Ab2以及T-m Ab3(我室从头设计制备的一株与T-m Ab1作用表位相同的抗体)与毒素分子DM1、MMAE偶联形成的ADC进行生物学活性对比研究。研究结果 1、通过距离几何学、计算机图形学技术,借助搭建的抗体T-m Ab1与抗原HER2胞外区作用复合物结构,合理判定了二者相互识别的关键区域;利用计算机辅助分子模拟、对接技术对于抗体T-m Ab1轻链可变区潜在脱酰胺位点(LC-CDR1-Asn30)和重链可变区潜在的异构化热点(HC-CDR3-Asp102)进行合理优化突变,搭建新抗体T-m Ab2空间结构及其与HER2胞外区相互作用复合物结构。T-m Ab1和T-m Ab2与HER2相互作用模式理论预测结果表明:与T-m Ab1相比,T-m Ab2的稳定性提高,但与HER2的结合活性有所下降。2、质谱、肽图等研究结果显示,在T-m Ab2抗体中,降解热点LC-CDR1-Asn30、HC-CDR3-Asp102被成功突变为LC-CDR1-Gln30和HC-CDR3-Glu102;抗体理化性质分析显示,T-m Ab2与T-m Ab1具有相似的多聚体水平、相同的等电点,但是T-m Ab2的电荷变异体水平要明显低于T-m Ab1。3、FACS、ELISA等体外结合活性实验结果表明,T-m Ab2能够特异地识别HER2抗原,但其结合活性要弱于T-m Ab1(约3倍);Biacore亲和力分析结果与理论预测结果一致,抗体T-m Ab2亲和力弱于母本抗体T-m Ab1(4.7 n M vs 1.0n M),两者结合HER2抗原的结合速度相近,但是解离速度比T-m Ab1快大约5倍。T-m Ab2在体外细胞模型中能有效抑制乳腺癌细胞增殖,但其抑制活性略弱于T-m Ab1;在体内移植瘤动物模型实验中,与生理盐水对照组相比,Herceptin®、T-m Ab1以及T-m Ab2均有明显的抑瘤活性,且三者的抑瘤活性没有明显差异。4、在长期稳定性(4℃)和加速稳定性(25℃)研究中,p H 5.1、6.0和6.3条件下,T-m Ab1和T-m Ab2的稳定性基本一致。在40℃高温、不同p H条件下,T-m Ab1和T-m Ab2的多聚体水平也无明显差异,但是二者的电荷变异体有显著的差异。p H6.0和6.3条件下,抗体T-m Ab1可以检测到明显的由LC-CDR1-Asn30脱酰胺引起的酸性变异体(AP2),且随着p H的增加AP2的含量也明显增加;而T-m Ab2抗体则没有检测到酸性变异体(AP2)。T-m Ab1和T-m Ab2中均只有在p H 5.1条件下可检测到酸性变异体AP1(由抗体Fc段VSNK序列中的N,在酸性条件下脱酰胺产生),且两者之间无明显差异。在T-m Ab1中,可以检测到明显的由HC-CDR3-Asp102异构化产生的碱性变异体(BP1),且随着p H的降低BP1的含量逐渐增加;而在T-m Ab2中未检测到明显的BP1变异体。并且,与T-m Ab1相比,T-m Ab2在抗体可变区进行的氨基酸突变没有引入新的翻译后修饰。5、在乳腺癌细胞系SKBR3中,母本抗体T-m Ab1偶联毒素分子DM1后结合活性无明显变化,但偶联毒素分子MMAE后结合活性略有下降;抗体T-m Ab2和T-m Ab3偶联毒素分子DM1和MMAE后,结合活性无明显变化。而在胃癌细胞系N87中,T-m Ab1、T-m Ab2和T-m Ab3分别与两种毒素分子偶联后,结合活性均有下降,其中T-m Ab1下降最为明显。T-m Ab1-DM1、T-m Ab2-DM1和T-m Ab3-DM1三种ADC可明显杀伤肿瘤细胞SKOV3和SKBR3,其杀伤活性无明显差异;且均要明显高于对胃癌细胞N87的杀伤;T-m Ab1-MMAE、T-m Ab2-MMAE和T-m Ab3-MMAE三种ADC对SKOV3和SKBR3均有明显的杀伤作用,且杀伤活性无明显区别;而三种ADC抗体对胃癌细胞的杀伤活性要明显高于SKOV3和SKBR3。在SKOV3和SKBR3中,同一抗体偶联不同毒素对细胞的杀伤无明显差异;但在胃癌细胞N87中,抗体T-m Ab1、T-m Ab2、T-m Ab3偶联MMAE形成的ADC的杀伤活性要明显高于其偶联DM1形成的ADC,分别高约12倍、42倍和28倍。结论： 1、Herceptin的脱酰胺和异构化的两个降解热点突变后,其稳定性明显得到了提高,虽然其体外结合活性略有下降,但是不影响其体内的抑瘤活性。2、抗体与DM1、MMAE等小分子偶联形成的ADC细胞毒作用具有一定的细胞选择性。三种抗体与DM1偶联的ADC对SKOV3、SKBR3细胞的杀伤作用要强于N87细胞;而与MMAE偶联的ADC对N87细胞的杀伤作用强于对SKOV3及SKBR3细胞。并且,在胃癌细胞N87中,抗体偶联MMAE形成的ADC的杀伤活性要明显高于其偶联DM1形成的ADC。本研究创新之处在于:本研究初步探讨了借助计算机虚拟筛选提高抗体稳定性的潜在策略。基于该策略,以靶向HER2抗体Herceptin为模型,筛选获得一个稳定性提高、保持母本抗体生物学活性的新抗体T-m Ab2。抗体稳定性提高有利于其保存。本研究还系统评价了不同毒素分子偶联对抗体生物学活性的影响。研究提示,抗体-小分子偶联物(ADC)的生物学活性具有一定的细胞选择性。