虾青素合成酶基因bkt和crtZ转化盐生杜氏藻的研究

来源 :辽宁师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dyjianing88
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虾青素是一种具有很高经济价值的β-胡萝卜素衍生物,具有非常强的抗氧化性,被广泛应用于制药和保健品生产中。盐生杜氏藻(Dunaliella salina)是咸水微藻,其适应性极强,生长速度快,培养成本低廉,其积累的β-胡萝卜素可达到干重的10%以上。但是盐生杜氏藻缺乏合成虾青素的酶,不能将β-胡萝卜素转化为虾青素。作者试图通过基因枪转化法将虾青素合成的关键酶基因β-胡萝卜素酮化酶基因bkt和β-胡萝卜素羟化酶基因crtZ导入盐生杜氏藻中,经筛选获得可以合成虾青素的转化盐生杜氏藻,证明外源虾青素合成酶基因bkt和crtZ可以在盐生杜氏藻中表达并具有催化功能。同时,转化的盐生杜氏藻可以作为新虾青素生产藻种用于生产虾青素。这对于利用盐生杜氏藻生产虾青素具有重要意义。实验以雨生红球藻(Haematococcus pluvislis)为材料,提取雨生红球藻的总RNA反转录后进行PCR,克隆获得bkt和crtZ基因。bkt全长为1363bp,ORF为990bp,编码329个氨基酸;crtZ全长为1138bp,ORF为882bp,编码293个氨基酸。选择pEGAD作为转化的表达载体,将bkt和crtZ基因与pEGAD载体连接,成功构建了重组载体pEGAD-bktO和p EGAD-crtZO。采用氯霉素处理获取无菌的盐生杜氏藻,经筛选发现氯霉素浓度为15μg/m L是获取无菌藻的最佳浓度。利用基因枪介导的转化方法将构建的重组载体pEGAD-bktO和pEGAD-crtZO转化至无菌的盐生杜氏藻中。以浓度为3.5μg/mL的草丁膦除草剂进行筛选。获得转化藻株后,提取转化藻株的基因组DNA进行PCR检测,筛选获得转化的盐生杜氏藻。在高光强下诱导转化藻株合成虾青素,通过HPLC分析,测得转化盐生杜氏藻的虾青素含量为3.71μg/gdw。
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