柠檬酸是一种重要的有机酸,广泛应用于食品、医药与工业领域。目前柠檬酸主要是通过生物发酵的方式获得,其中黑曲霉是工业发酵的主要菌株。然而,黑曲霉发酵产生的废物易污染环境,并且发酵控制技术要求高,对菌株的遗传改造难度也大。在柠檬酸的发酵生产中,解脂耶罗威亚酵母菌能够克服黑曲霉生产中的不足,已经成为近年来研究的热点,作为柠檬酸工业生产菌株也逐渐被人们所认同。在其他人的研究中发现,丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase)在有机酸合成方面有着很大的作用。该酶催化丙酮酸形成草酰乙酸,在酵母油脂合成与琥珀酸、α-酮戊二酸以及苹果酸等有机酸积累方面有着重要作用。柠檬酸是草酰乙酸与乙酰CoA通过缩合作用形成的,因此我们认为丙酮酸羧化酶在柠檬酸合成中也起着某些重要作用。为了进一步研究丙酮酸羧化酶在柠檬酸合成调控中的作用,本论文分别克隆了季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii) Pcla22菌株和海洋霉菌产红青霉(Penicillium rubens) 1067菌株的丙酮酸羧化酶基因,并将这些基因在解脂耶罗威亚酵母(Yarrowia lipolytica) SWJ-1 b菌株中进行了表达。pINA1312质粒是适用于在解脂耶罗威亚酵母(Y.lipolytica)中高效表达外源基因的质粒。但在实际应用中,该质粒由于多克隆位点区域可用的酶切位点过少,在表达外源基因的过程中受到了很大的限制。本研究采用引物人工退火与酶切连接的方法,成功构建pINA1312-GY质粒,在pINA1312质粒上增加3个新的酶切位点,为外源基因在Y. lipolytica中表达构建了方便有效的工具。季也蒙毕赤酵母(P. guilliermondii是一株已全基因组测序的菌株,具有遗传背景清楚和高产有机酸的优点。将一株分离自海洋的季也蒙毕赤酵母Pcla22菌株的丙酮酸羧化酶基因(PYC)在解脂耶罗威亚酵母SWJ-1b菌株中进行了表达。研究发现,转化子PG86的丙酮酸羧化酶酶活和柠檬酸产量都明显高于原始菌株SWJ-1b。在补料发酵条件下,转化子PG86的发酵液柠檬酸浓度为101.0士1.3g/l,糖转化为柠檬酸的得率为0.89g/g。HPLC检测表明发酵产物主要为柠檬酸。这表明丙酮酸羧化酶基因(PYC)得到了超表达,且该酶在柠檬酸合成调控中具有重要作用,超表达丙酮酸羧化酶可以促进柠檬酸的累积。海洋霉菌产红青霉(P.rubens)是一株高产有机酸的菌株,目前对它的研究还很少。本实验采用简并引物和基因组步移的方法,克隆了产红青霉(P.rubens)1067菌株的丙酮酸羧化酶基因及其上下游调控区基因。该菌丙酮酸羧化酶基因(登录号：KM397349.1)ORF框共3534 bp,编码1177个氨基酸,预测的蛋白质分子量为127.531kDa,等电点pI 6.20。启动子位于基因上游-1200 bp位置,包含一个TATAA框、多个CAAt框和5’-SYGGRG-3’序列。该酶无信号肽,为同源四聚体结构(α4),每一单体包含四个功能区域。为了进一步提高柠檬酸产量,将1607菌株的丙酮酸羧化酶基因(RPYC)在解脂耶罗威亚酵母SWJ-1b菌株中进行表达。研究发现,转化子PR32的丙酮酸羧化酶酶活可达0.53 U/mg,高于相同条件下SWJ-1b菌株和PG86菌株的酶活(分别为0.07 U/mg和0.38U/mg)。测定了补料发酵条件下转化子PR32菌株的产柠檬酸能力,发现其发酵液中柠檬酸浓度为111.1±1.3 g/l,糖转化为柠檬酸的得率为0.93 g/g。进一步表明,提高丙酮酸羧化酶酶活力,可以将更多的CO2固定到糖代谢中并生成更多的草酰乙酸,进而草酰乙酸和乙酰CoA合成了更高水平的柠檬酸。