糖尿病视网膜病变(DiabeticRetinopathy,DR)是糖尿病常见的并发症之一,在世界范围内DR受累人群约占糖尿病患者总数的35%,且伴随近年来糖尿病发病率的持续增高,DR患者数量也呈现爆发式的增长。作为一种具有特异性改变的眼底病变,DR病理实质为视网膜毛细血管的异常增生,因此对血管新生途径抑制成为目前临床上糖尿病视网膜病变治疗的主要思路。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的、进化高度保守的小分子非编码RNA,其广泛表达于人体多种细胞内并参与调控细胞增殖、分化、迁移及凋亡等生物学事件。近年来研究表明miRNAs表达变化与诸多疾病的发生发展密切相关,其可通过直接或间接方式作用于调控因子和信号通路形成多层次、全方位的网络调控系统参与疾病病理过程,目前已明确多种miRNA可作为生物标志物用于肿瘤、心脑血管疾病、肝脏疾病及炎症的诊断及治疗。研究发现DR病理过程中同样存在miRNAs表达失调,通过对miRNAs表达谱分析已鉴定获得多种与DR病理相关的miRNAs,而某些miRNA更是可通过抑制新生血管的形成调控糖尿病视网膜损伤程度。miR-128作为与血管内皮细胞及血管功能密切相关的一种miRNA,其定位于染色体2q21.3和3p22.3,研究发现miR-128可靶向作用于多种血管新生因子如RTKs、EGFR、PDGFRα及p70S6K1等抑制血管新生过程。近年来研究显示miR-128也参与调控糖尿病视网膜病变过程,认为其可作为潜在指标用糖尿病视网膜病变诊断,但目前对其作用机制尚无明确定论。HoxB基因家族是目前经研究证实与血管发生最为密切的一类Ⅰ型同源盒基因,在人脐静脉内皮细胞可检测到多种HoxB基因簇成员的高表达,它可通过直接调控促血管新生因子如TGF-β、VEGF、CXCL1、IL-8、Ang-2、MMP-9表达影响血管分化及内皮细胞成熟过程。HoxB3作为HoxB基因家族中的一员,研究发现其与毛细血管丛形成密切相关,在构建血管分支及改善血管密度方面有着重要作用。应用TargetScan、PicTar和miRBase预测显示HoxB3为miR-128潜在靶点,鉴于微血管病变是DR核心病理事件,而HoxB3基因与毛细血管构建密切相关,我们推测miR-128可能通过靶向作用HoxB3调节视网膜新生血管形成过程。因此本研究中我们构建了糖尿病大鼠模型及高糖诱导细胞模型,通过体外及体内实验探讨miR-128在糖尿病视网膜病变过程中的可能作用,并对其作用机制进行了阐明,为今后miR-128用于DR的诊断及治疗提供理论依据。研究目的分析糖尿病模型大鼠视网膜miR-128表达变化;检测高糖对人视网膜色素上皮细胞miR-128及HoxB3表达影响,明确PI3K/AKT/m-TOR通路变化情况;验证HoxB3为miR-128靶基因,探讨高糖培养条件下过表达或抑制miR-128对人视网膜色素上皮细胞增殖及凋亡的影响,明确miR-128对HoxB3及PI3K/AKT/m-TOR通路的调控作用。研究方法1.链脲佐菌素诱导建立糖尿病大鼠模型,测定大鼠体重及血糖变化,荧光定量PCR法检测视网膜组织中miR-128 mRNA表达水平;2.取对数生长期ARPE-19细胞随机分为两组,分别为正常糖组(对照组,5.5 mM)及高糖组(25 mM),分别加入含10%胎牛血清的正常糖DMEM培养液及高糖DMEM培养液,培养6 h、12 h、24 h、48 h后,MTT法测定ARPE-19细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡,ELISA法分析培养上清中VEGF含量,荧光定量PCR法检测视网膜组织中miR-128 mRNA表达水平,Western-blot法分析高糖刺激对HoxB3及PI3K/AKT/m-TOR通路影响;3.给予ARPE-19细胞转染miR-128 mimics或miR-128 inhibitor,取未转染及转染ARPE-19细胞,分为对照组(Control group)及高糖组(HG group),加入含10%胎牛血清高糖DMEM培养液(25 mM)继续培养48 h后,MTT法测定ARPE-19细胞活性,流式细胞仪检测细胞凋亡,ELISA法分析培养上清中VEGF含量,荧光定量PCR法检测视网膜组织中miR-128 mRNA表达水平,Western-blot法分析高糖刺激对HoxB3及PI3K/AKT/m-TOR通路影响,双荧光素酶报告基因检测验证miR-128对HoxB3的调控作用结果1.与对照组相比,STZ注射后2 w后模型组大鼠体重明显降低(p<0.05),不同处理节点模型组大鼠体重无明显变化。2.给予大鼠注射STZ诱导糖尿病,测定血糖以确认是否建模成功。血糖值需维持>16.0mmol/L水平。本实验中模型组大鼠血糖水平为30.4mmol/L,与对照组相比显著上升(p<0.05),且一直持续至处死节点。3.糖尿病模型组大鼠视网膜miR-128 mRNA表达伴随处理时间的延续持续性增加(Fig.1-3),与对照组相比,模型组大鼠视网膜miR-128 mRNA表达水平显著上调。4.ARPE-19细胞分别给予正常糖和高糖DMEM培养液,培养6h、12h、24h、48h后,MTT法检测细胞存活率,结果显示高糖刺激6h ARPE-19细胞活性与对照组相比无明显差异;作用12 h后,高糖组ARPE-19细胞增殖活性显著降低(P<0.05);对比6 h、12 h、24 h、48 h高糖条件下ARPE-19细胞活力,可见伴随作用时间的延续ARPE-19细胞活性持续降低,表现为作用时间依赖性。5.对照组细胞凋亡率约为(0.86±0.05)%,ARPE-19细胞经高糖刺激6 h后细胞凋亡率与对照组无明显差异,高糖作用12 h时,ARPE-19细胞凋亡率为(3.39±0.79)%,与对照组相比高糖刺激12hARPE-19细胞凋亡率显著增加(P<0.05);作用24h时高糖刺激组细胞凋亡率持续增加,至48 h时ARPE-19细胞凋亡率为(9.89±1.21)%。6.ARPE-19细胞分别给予正常糖和高糖DMEM培养液,培养6 h、12 h、24 h、48h后,测定细胞上清液中VEGF含量,结果显示处理6h,上清液中VEGF含量与对照组相比无明显变化,至12 h节点时,上清液中VEGF含量表现为一定程度的增加但与对照组无显著性差异,至24 h时,上清液中VEGF含量增加至(497.83±14.56)ng/L,明显高于对照组,高糖作用至48 h时,上清液中VEGF含量持续增加至(548.62±37.50)ng/L,提示高糖刺激可促进ARPE-19细胞VEGF分泌,且存在时间依赖性。7.qRT-PCR法分析高糖培养24 h、48 h时ARPE-19细胞中miR-128 mRNA表达水平,结果显示与对照组相比,高糖刺激ARPE-19细胞miR-128 mRNA表达显著下调(P<0.05),且miR-]28mRNA表达变化呈现时间依赖性。8.Western-blot法分析高糖培养24 h、48 h时ARPE-19细胞中HoxB3表达水平,结果显示与对照组相比,高糖刺激后ARPE-19细胞HoxB3表达显著增加(P<0.05)。9.高糖刺激24 h时ARPE-19细胞p-AKT、p-PI3K及m-TOR蛋白白表达显著增加,与对照组相比,高糖刺激组ARPE-19细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值明显上调,提示高糖刺激可促进PI3K/AKT-mTOR通路的活化(P<0.05)。10.将 miR-128 mimics 及 miR-128 inhibitor 分别转染至 ARPE-19 细胞,为验证转染效果,荧光定量PCR法检测转染后ARPE-19细胞中miR-128 mRNA表达水平,结果显示miR-128 mimics转染后,ARPE-19细胞中miR-128表达水平显著上调(P<0.01),而给予miR-128 inhibitor转染细胞组中miR-128水平则显著降低(P<0.01),提示 miR-128 mimics/inhibitor 转染成功,给予 miR-128 mimics/inhibitor 转染后可干预 ARPE-19 细胞 miR-128 表达。11.将miR-128 mimics转染至ARPE-19细胞,加入含10%胎牛血清高糖DMEM培养液(25 mM)继续培养48 h,MTT法检测ARPE-19细胞活力,结果显示高糖状态下,miR-128过表达组细胞活力明显高于对照组相比,提示miR-128过表达可拮抗高糖刺激对视网膜上皮细胞的损伤作用。12.高糖状态下,miR-128过表达及表达抑制组细胞凋亡率分别为(2.97±0.31)%和(12.79±2.38)%,与对照组相比miR-128过表达组细胞凋亡率显著降低,而表达抑制组则呈现增加趋势,提示miR-128过表达可拮抗高糖的促凋亡作用。13.高糖培养条件下,miR-128过表达组细胞培养上清中VEGF含量为(480.71±49.46)ng/L,与对照组相比miR-128过表达组细胞培养上清中VEGF水平显著下调;miR-128表达抑制组培养上清中VEGF含量为(674.23±59.71)ng/L,明显高于对照组,提示miR-128表达的改变可影响ARPE-19细胞VEGF分泌能力。14.miR-128过表达可显著下调高糖模型组中HoxB3 mRNA表达水平,在miR-128表达抑制组中HoxB3 mRNA则表现为上调趋势,提示miR-128可影响HoxB3基因mRNA表达量。15.miR-128过表达及表达抑制组HoxB3蛋白表达水平均发生的不同程度的变化,miR-128过表达可下调高糖模型组HoxB3蛋白表达,与对照组相比miR-128过表达组HoxB3蛋白表达显著降低;miR-128表达抑制可在一定程度上促进HoxB3的转录后翻译,表现为HoxB3蛋白水平的增加,表明miR-128可通过转录后水平调控HoxB3表达。16.miR-128过表达可下调高糖模型组p-AKT、p-PI3K及m-TOR蛋白表达水平,miR-128表达抑制则可使高糖模型组p-AKT、p-PI3K及m-TOR蛋白呈现不同程度的升高,对total-AKT和total PI3K分析证实miR-128对total-AKT和total PI3K表达变化无明显作用,以上结果表明miR-128可影响PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化状态。17.前期研究显示miR-128不仅在转录水平还在翻译水平上均可下调的HoxB3表达,为了明确miR-128是否对HoxB3具有直接调控作用,我们将野生型HoxB3 mRNA 3’UTR序列构建至pMIR荧光素酶报告载体中,获得野生型HoxB33’UTR荧光素酶报告质粒并命名为HoxB3-pMIR3’-UTR(WT),同时构建突变型HoxB3 3’UTR荧光素酶报告质粒命名为HoxB3-pMIR 3’-UTR(MUT),并将野生型HoxB3-pMIR3’-UTR(WT)质粒、突变型HoxB3-pMIR3’-UTR(MUT)、空载体pMIR与miR-128 mimics共同转染至HEK-293T细胞中,结果显示,与对照组相比,miR-128过表达后含有野生型HoxB3 3’UTR转染组的荧光素酶活性降低,而突变型HoxB3-pMIR 3’-UTR(MUT)可逆转miR-128对荧光素酶活性的抑制作用,表明miR-128可通过3’-UTR靶向作用HoxB3。结论1.STZ所致糖尿病模型大鼠视网膜miR-128 mRNA表达显著上调,且伴随干预时间的延续其表达持续性增加,提示miR-128参与调控了糖尿病视网膜病变过程。2.高糖刺激后,ARPE-19细胞活性降低,凋亡率增加伴随上清液中VEGF水分上升,提示高糖干预可损伤ARPE-19细胞功能,影响细胞VEGF的分泌。3.高糖刺激可抑制ARPE-19细胞miR-128 mRNA水平,促进HoxB3蛋白表达,且存在时间依赖性。4.高糖培养状态可激活ARPE-19细胞PI3K/AKT/mTOR信号促进VEGF表达。5.阐明了 miR-128在高糖致视网膜上皮细胞损伤模型中的保护作用,并证实HoxB3为miR-128靶基因。6.miR-128对视网膜上皮细胞功能的调控作用是通过多途径介导实现的,它可通过直接靶向HoxB3或间接干预PI3K/AKT/mTOR信号活化以缓解高糖对视网膜色素上皮细胞的损伤作用,改善细胞功能。