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近年来,随着分子生物学技术的不断发展,使得从化石中提取出DNA成为现实,通过对这一重要的遗传信息进行分析,能较为准确的反映生物的结构特征及生物类群之间的系统发育关系,使人们了解漫长的地质年代中生物的起源、进化、灭绝以及地理谱系关系等重要问题。
披毛犀(Coelodonta antiquitatis Blumenbach)是已灭绝的最著名的冰期动物之一,曾广泛分布于欧亚大陆北部,是在更新世冰期气候影响下逐步发展起来的类型。关于披毛犀的灭绝原因、地理谱系、及与现生犀牛的亲缘关系等一直是研究的热点,通过传统(非DNA)方法研究披毛犀与五种现生犀牛的系统发生存在很多争议。到目前为止,世界上对披毛犀的古DNA研究进行的非常有限,公开报道的仅有三例,样品采集地主要集中在欧洲和北亚地区。披毛犀化石在我国很丰富,密集分布在东北松辽平原,除此以外,华北平原,内蒙古高原,黄土高原陇东地区甚至青藏高原的西南部都有分布。当地的土壤气候条件比较适合古DNA的保存,这为我们在中国开创披毛犀的古DNA研究提供了优越条件。
本研究从我国北方四个地点采集到披毛犀样品,其中辽宁海城县小孤山披毛犀样品的地层年龄约为4—5万年,鉴定确认为该样品是披毛犀下臼齿齿根部位。按照学术界公认的古DNA研究可靠性标准,我们采自不同地点的披毛犀样品进行了科学严谨的古DNA分析,经分子生物学实验包括多重PER扩增、电泳检测、纯化、克隆及测序,获得了可靠的吉DNA数据。由于在不同的地方不同的环境下,样品的吉DNA保存情况差异很大,海城县小孤山的晚更新世披毛犀化石样品中成功的获取到了1080 bp细胞色素b基因序列,其他三个地点的样品降解较为严重。
运用分子生物学软件Clustal X对其Cyt b基因序列进行同源序列比对分析;用MEGA4.0软件计算核苷酸碱基组成,统计转换和颠换,计算转换/颠换及Kirnura2-参数模型校正后的遗传距离,统计密码子使用频率,构建系统发育树;用Dnasp4.10进行核苷酸多样度和Cyt b基因变异位点分析;用DAMBE(Ver.4.2.13)计算Cyt b基因的饱和程度。分别采用邻接法(NJ法)、最小进化法(ME法)、最大简约法(肝法)和算术平均的不加权对群法(UPGMA法)构建系统发育树,均分为三个分支:黑犀牛/白犀牛,印度犀/爪哇犀,苏门答腊犀/披毛犀,表明披毛犀与现生苏门答腊犀的亲缘关系最为接近。其中,在披毛犀分支中,西伯利亚与雅库特的披毛犀聚为一个分枝,构成披毛犀的北亚谱系,而中国辽宁海城小孤山的披毛犀样品处于整个披毛犀分支的根部,从分子水平上说明披毛犀可能起源于中国。