应用Faecalibacterium菌作为水体粪便污染指示菌的研究

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传统的示踪微生物大肠杆菌(E.coli)、粪肠球菌属(Enterococcus spp.)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、产气荚膜菌(Clostridium perfringens)、普雷沃氏菌(Prevotella)、动物肠道病毒等在水质示踪检测中存在较多局限性,难以准确示踪水体污染程度。最新的研究表明:Faecalibacterium菌是人和动物肠道中的优势菌群,不同宿主肠道内的Faecalibacterium菌基因上存在显著差异。根据这些基因差异可以区分粪便来源,可极大的弥补传统粪便污染示踪微生物的缺陷。通过设计的一对通用引物FaU-F和FaU-R对人、猪、牛、羊、鸡和鸭六种动物粪便中的Faecalibacterium菌进行了检测,实验结果显示:选取的六种动物的粪便基因组DNA样品中都扩增出了相同大小的目的片段,片段大小为500bp,说明了人和动物肠道Faecalibacterium菌的广泛存在的特性。根据人肠道内Faecalibacterium菌设计的一对引物HFB-F3和HFB-R5对人粪便基因组DNA进行了多次PCR扩增反应,结果表明:最适PCR反应条件为:退火温度为55℃,引物浓度为10μmol/L,模版为50ng,扩增循环数是35次。采用HFB-F3和HFB-R5引物对提取的人粪便基因组DNA进行检测,采集的10例粪便样品中有6例扩增出来目的条带,片段大小为399bp,阳性扩增率为60%。选取的鸡,鸭,猪,狗,牛五种动物粪便样品基因组DNA作为特异性对照试验,所有样品均未有目的条带产生。根据鸡肠道内Faecalibacterium菌设计的两对特异性引物FaCH-F1、FaCH-R1和FaCH-F2、FaCH-R2对鸡粪便粪便污染进行了检测,研究结果显示:利用第一对引物在40%鸡的粪便样品中扩增出现了97bp的目的条带,利用第二对引物在70%鸡的粪便样品中扩增出了132bp的目的条带。说明引物二的灵敏度强于引物一,利用这两对引物都能够示踪鸡粪便中的Faecalibacterium菌,达到检测鸡粪便污染水质的目的。经基因克隆、测序确定了鸭肠道Faecalibacterium菌16S rDNA的保守序列,并以此设计了可针对性扩增鸭肠道Faecalibaterium16S rDNA的PCR引物。用此引物对鸭粪便Faecalibacterium菌构建了16S rDNA序列文库。结果在200份克隆中找到了四条特异性序列片段,设计出了四对特异性引物。本文研究了Faecalibacterium菌作为水体粪便源污染指示菌的优势,并针对水环境中的Faecalibacterium菌的检测方法进行了初步研究,应用该方法可以区分不同动物的粪便来源,并且稳定性较好,有着较为广泛的应用前景。
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